復(fù)方黃連消瘡靈治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的免疫學(xué)機(jī)制研究

楊志誠，吳麗芳，郭其，張君利，呂劍濤,3*

(1.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院，山東 煙臺 264100;2.煙臺市福山區(qū)人民醫(yī)院， 山東 煙臺 264100;3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250101)

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍(ROU)為臨床上常見的口腔黏膜病變之一，發(fā)病率高達(dá)20%。其與中醫(yī)學(xué)中的“口瘡”或“口瘍”極其相似，中醫(yī)學(xué)對其病因病機(jī)的認(rèn)識主要集中在“陰虛火旺”和“心脾積熱”兩方面，由于ROU的病因和發(fā)病機(jī)制不明，目前尚無特效治療方法[1-3]。復(fù)方黃連消瘡靈為臨床上治療ROU的常用藥，療效顯著。本研究將其作用于復(fù)發(fā)性口腔潰瘍模型大鼠，通過觀察外周血中T細(xì)胞亞群比例(CD3+、CD4+、CD8+)的變化探討其可能的作用機(jī)制，以達(dá)到為臨床提供用藥參考的目的。

1 材料與儀器

1.1 藥物

處方由黃連、青黛、石膏、硼砂、乳香、沒藥、珍珠、冰片組成，均由濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院中藥房提供。

1.2 制備方法

將八味中藥按原處方比例稱取藥材，加入適量水，浸泡l h，回流提取2次(第1次以10倍量水提取2 h，第2次以8倍量水提取1.5 h)，合并提取液，濃縮，減壓干燥得干浸膏，備用，1 g相當(dāng)于6.37 g生藥量。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠110只，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.4 儀器及試劑

組織勻漿器(南京建成生物工程研究所)；高速離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；完全費(fèi)氏佐劑(美國Sigma公司)；電子天平(梅特勒上海有限公司)；guava easyCyte 5HT流式細(xì)胞儀(美國Millipore公司)。

2 方法

2.1 對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍大鼠影響

取健康SD大鼠10只，腹腔注射戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉大鼠，將0.1 ml生理鹽水皮下注射于口腔黏膜下，取下凸起的口腔黏膜，生理鹽水沖洗3次，使用玻璃研缽磨碎，加入0.1 ml、pH值7.4的PBS緩沖液，繼續(xù)研磨成勻漿，低溫冰箱保存?zhèn)溆?。在制作大鼠模型時(shí)，加入等體積的完全弗氏佐劑，在振蕩器上振搖2～5 min充分混勻，混勻后的試液呈乳狀且放置不分層。除正常對照組外將現(xiàn)用現(xiàn)配的組織乳化劑皮內(nèi)注射于大鼠背部脊柱兩側(cè)(100只)，各0.1 ml，1次/周，共4次，正常對照組大鼠相同部位注射等容量的生理鹽水。5周后觀察發(fā)現(xiàn),注射了抗原乳化液的模型大鼠大多數(shù)出現(xiàn)口腔潰瘍，正常對照組未見有口腔潰瘍的發(fā)生，黏膜紅潤。

取造模成功大鼠50只，隨機(jī)分為復(fù)方黃連消瘡靈高劑量組(1.8 g/kg生藥量)、復(fù)方黃連消瘡靈中劑量組(0.9 g/kg生藥量)、復(fù)方黃連消瘡靈低劑量組(0.45 g/kg生藥量)、模型對照組、左旋咪唑組(20 mg/kg)、每組10只。在第5周復(fù)發(fā)性口腔潰瘍模型造模成功后采用灌胃給藥，模型、正常對照組大鼠均灌胃給予等容量的純水，每日1次，共14 d。密切觀察并記錄各組大鼠發(fā)生潰瘍的持續(xù)時(shí)間和數(shù)目。

在給藥14天后，腹腔注射戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血3 mL，置肝素抗凝管中搖勻，然后吸取抗凝全血,在不破壞液體交界面的前提下加至等量淋巴細(xì)胞分層液的上層。2 500 r/min離心10 min，使用吸管將中間白色細(xì)胞層吸出置于新的試管中。加入3 mL pH值7.2～7.4緩沖液混勻，然后1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，再加入200 μL緩沖液混勻，使用血球計(jì)數(shù)板對淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整各待測管的細(xì)胞濃度分別為2×106/mL。吸取調(diào)整后的細(xì)胞100 μL置于離心管中，分別加入單克隆抗體，振蕩混勻，4℃避光染色30 min。以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液；每管加入300 μL緩沖液，混勻，使用流式細(xì)胞儀檢測[4-7]。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，如果方差齊，則使用LSD檢驗(yàn)，如果方差不齊，則使用Dunnett T3，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍大鼠潰瘍數(shù)目、持續(xù)時(shí)間影響

與模型對照組比較，復(fù)方黃連消瘡靈高、中劑量組、左旋咪唑組可以顯著縮短潰瘍的持續(xù)時(shí)間，減少潰瘍數(shù)目(P<0.01，P<0.05)。具體結(jié)果見表1。

表1 對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍大鼠潰瘍數(shù)目、持續(xù)時(shí)間的影響

注：與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

3.2 對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍大鼠T細(xì)胞亞群比例的影響

與模型對照組比較，復(fù)方黃連消瘡靈高劑量組、左旋咪唑組可以顯著升高CD3+CD4+細(xì)胞水平(P<0.05)；但對CD3+CD8+細(xì)胞水平影響不明顯(P>0.05)；復(fù)方黃連消瘡靈高劑量組、左旋咪唑組可以顯著升高CD4+/CD8+比值水平(P<0.05)。具體結(jié)果見表2。

表2 對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍大鼠T細(xì)胞亞群比例影響

注：與模型對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

4 討論

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的病因至今仍不明確，大多間歇性發(fā)作，且表現(xiàn)出自限性，本病多在1～2周內(nèi)即可自愈，愈后良好，多不留瘢痕；有局限性口腔黏膜潰瘍性損傷的特點(diǎn)，常常表現(xiàn)為進(jìn)食、說話時(shí)疼痛，影響患者的工作、生活，且長期潰瘍不愈易出現(xiàn)惡變[8-9]。

復(fù)方黃連消瘡靈由黃連、青黛、石膏、硼砂、乳香、沒藥、珍珠、冰片8味中藥組成，以清熱祛濕、瀉火解毒為法，在臨床應(yīng)用中取得了較好的療效。復(fù)方黃連消瘡靈以黃連、青黛為君藥，清熱涼血解毒;以石膏、硼砂、乳香為臣藥，解肌清熱消腫、血分虛實(shí)之熱;佐以沒藥、珍珠，定痛收斂生肌;使以冰片，通諸竅散郁火。

T淋巴細(xì)胞是人體內(nèi)參與免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，發(fā)揮著機(jī)體的免疫監(jiān)視功能，正常機(jī)體的T淋巴細(xì)胞各亞群之間是相互平衡、相互調(diào)節(jié)的，從而使機(jī)體發(fā)揮正常的免疫應(yīng)答作用，對外來抗原產(chǎn)生刺激，使機(jī)體的免疫應(yīng)答處于平衡狀態(tài)。如果平衡被破壞免疫調(diào)節(jié)紊亂，必將導(dǎo)致疾病的發(fā)生，目前醫(yī)學(xué)臨床上免疫狀態(tài)檢測指標(biāo)主要是CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群在血液中的分布。聶建芳等[8]對138例ROU患者進(jìn)行治療，用細(xì)胞流式儀檢測患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平，經(jīng)過治療后，ROU患者血T淋巴細(xì)胞亞群平衡發(fā)生改觀并伴隨癥狀改善。功能性T淋巴細(xì)胞的特異性是預(yù)防自身特異性疾病的重要屏障，組織特異性T細(xì)胞減少可導(dǎo)致局部口腔潰瘍的發(fā)生[10-11]。鑒于此，本研究從T細(xì)胞亞群的角度探討復(fù)方黃連消瘡靈治療ROU的作用機(jī)制，檢測模型大鼠給藥后CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞比例的變化。結(jié)果顯示，治療后ROU模型大鼠外周血CD4+、CD4+/CD8+細(xì)胞比例均顯著升高，提示復(fù)方黃連消瘡靈治療ROU的作用機(jī)制與改善T細(xì)胞亞群的比例有關(guān)。

綜上所述，復(fù)方黃連消瘡靈可以顯著縮短潰瘍的持續(xù)時(shí)間，減少潰瘍數(shù)目；這可能是通過改善T細(xì)胞亞群的比例，從而達(dá)到治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的目的。

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