大黃蟄蟲丸對大鼠深靜脈血栓形成模型TNOS、iNOS及超微結構的影響

回雪穎，郭偉光，滕林，張海麗，于洋

(黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

下肢深靜脈血栓形成(Deep venous thrombosis，DVT)是周圍血管病中常見的靜脈系統(tǒng)疾病，屬中醫(yī)學“股腫”范疇。本實驗通過建立大鼠深靜脈血栓形成模型，觀察大黃蟄蟲丸對DVT總一氧化氮合酶(TNOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)及光、電鏡下靜脈標本超微結構的影響，證實大黃蟄蟲丸對DVT的療效并探討其作用機理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

12周齡清潔級Wistar大鼠48只，雌雄各半，體質量200～220 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑

一氧化氮合酶(NOS)檢測分型試劑盒(武漢建成生物工程研究所)。

1.3 主要材料及器械

碘伏消毒液(上海利康消毒高科技有限公司)；組織剪、外科顯微剪、顯微鑷、顯微血管夾等(上海手術器械廠)；非吸收性外科絲線(杭州華威醫(yī)療用品有限公司)；吸收性明膠海綿(南昌市祥恩堂醫(yī)療器械有限公司)。

1.4 主要儀器

LDZ4-2自動平衡離心機(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)；722型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；日本OLYMPAUS BH-2光學顯微鏡；荷蘭TECNAI G2透視電鏡；德國萊卡2135型切片機；美國moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)。

1.5 受試藥物

實驗組使用藥物為大黃蟄蟲丸。藥物組成：熟地黃、土蟲、水蛭、虻蟲、蠐螬、干漆、桃仁、苦杏仁、黃芩、地黃、白芍、甘草。吉林省健今藥業(yè)股份有限公司，國藥準字Z19990064。將大黃蟄蟲丸(3 g/丸)用蒸餾水調勻，制成懸濁液。

對照組使用藥物為通塞脈片。藥物組成：玄參、金銀花、當歸、黃芪、黨參、牛膝、石斛、甘草。江蘇南星藥業(yè)有限公司，國藥準字232020535。將通塞脈片(0.35 g干浸膏/片)研為細末，用蒸餾水制成懸濁液。

2 實驗方法

48只Wistar大鼠隨機分為6組，即空白對照組、大黃蟄蟲丸高、中、低劑量組、通塞脈片組、模型組，每組8只，雌雄各半。

按臨床等效劑量為低劑量組得出，大黃蟄蟲丸低、中、高劑量分別為0.54 g/kg、1.08 g/kg和2.16 g/kg，通塞脈片用量為0.57 g/kg。灌胃給藥，每次2 ml，每日1次。空白對照組及模型組采用生理鹽水灌胃，每次2 ml，每日1次。

各組按體質量灌胃給藥10天。末次給藥2 h后，以10%的烏拉坦按0.1 ml/kg體質量腹腔麻醉，腹中部去毛，常規(guī)消毒，鋪巾，沿腹正中線剪開至肌層，腹腔暴露，生理鹽水紗布包裹移出腸管后，將其置于腹部右側。打開后腹膜，游離下腔靜脈與左腎靜脈匯合處，用4#外科非吸收性絲線于左腎靜脈下方結扎下腔靜脈，將腸管回納腹腔，用1#絲線依次連續(xù)縫合腹壁和皮膚，建立大鼠深靜脈血栓形成模型。術后6 h，開腹，心臟取血，離心10 min取血清，用722型可見分光光度計測定TNOS、iNOS；并取下腔靜脈血管標本，分別置于10%甲醛及10%多聚甲醛中固定，鏡檢。

TNOS、iNOS檢測原理：一氧化氮合酶催化L-精氨酸和分子氧反應生成NO，其與親核性物質生成有色化合物，在530 nm波長下檢測吸光度，依據(jù)吸光度的大小計算出NOS活力。

3 統(tǒng)計學處理

4 結果

4.1 大黃蟄蟲丸對TNOS、iNOS的影響

如表1所示，大黃蟄蟲丸、通塞脈片均可升高模型大鼠的TNOS含量，與模型組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。大黃蟄蟲丸、通塞脈片均可降低模型大鼠的iNOS含量，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 大黃蟄蟲丸對各組大鼠TNOS、iNOS的影響

注：與模型組比較，▲P<0.05；與空白對照組比較，★P<0.05，☆P>0.05；與通塞脈片組比較，※P>0.05

4.2 大黃蟄蟲丸對模型大鼠超微結構的影響

4.2.1 光鏡下組織學觀察

與空白對照組比較，模型組的血管內膜不規(guī)則，血管內皮細胞不全，但其脫落不明顯，管壁不連續(xù)，管腔內可見血栓形成，與血管壁無黏連。大黃蟄蟲丸組及通塞脈片組血管內膜較規(guī)則，內皮相對完好，部分內皮細胞脫落，血管壁較連續(xù)，管腔內可見少量血栓形成，相對通暢。結果見圖1。

圖1 各組大鼠深靜脈血栓形成模型光鏡結果

4.2.2 電鏡下組織學觀察

與空白對照組比較，模型組鏡下可見充滿血栓和炎性細胞，并可見血小板顆粒特征，可見肌層或表皮中層的破壞。大黃蟄蟲丸組及通塞脈片組鏡下可見中膜下有少量滲出及炎性細胞或中層較完好，內皮較連續(xù)，管腔內少有聚集血小板，內皮細胞胞漿較飽滿。結果見圖2。

圖2 各組大鼠深靜脈血栓形成模型電鏡結果

5 討論

下肢深靜脈血栓形成多由于創(chuàng)傷、手術、妊娠及其他長期臥床等因素所致，發(fā)病率較高。其并發(fā)癥肺栓塞具有致命風險。據(jù)報道約有50%的DVT患者由于認識不足、延誤治療演變成下肢深靜脈血栓形成后遺癥(Deepvenous postthrombotic syndrome DVTS)[1-3]，包括下肢腫脹、色素沉著、潰瘍等，嚴重影響患者的日常生活和工作。

中醫(yī)學認為,深靜脈血栓形成屬于“股腫”“脈痹”等范疇，早在《黃帝內經》中就有對本病的描述?！堆C論》指出：“瘀血流注，亦發(fā)腫脹，乃血變成水之證?！薄夺t(yī)宗金鑒》提到：“產后閃挫，瘀血作腫者，瘀血久滯于經絡，忽發(fā)則木硬不紅微熱?！惫时静∈且騽?chuàng)傷、產后或術后長期臥床導致氣虛或氣滯，使血行不暢，瘀阻脈絡，營血回流受阻，聚而為濕所致?！秲冉洝诽岬健把獙嵳咭藳Q之”，用大黃蟄蟲丸以祛瘀生新。大黃蟄蟲丸源自張仲景的《金匱要略》，具有攻補兼施的特點。方中大黃清熱活血化瘀，《本經》中描述其：“下瘀血，血閉寒熱，破癥瘕積聚”；蟄蟲破血逐瘀，《長沙藥解》曰：“(蟄蟲)本品善化瘀血，最補損傷”，二者共為君藥，能行能和，通達三焦以除瘀血。臣以水蛭、虻蟲、蠐螬、煅干漆、桃仁活血搜絡化瘀，共助君藥攻逐瘀血，《本經》中介紹水蛭“主逐惡血、瘀血”；虻蟲“逐瘀血，破下血積”；《長沙藥解》：“蠐螬，能化瘀血，最消癥塊?！薄墩渲槟摇贰?桃仁)治血結……，破蓄血”。佐以黃芩清解郁熱；苦杏仁宣肺氣，潤腸道，配伍桃仁，降肺氣，開大腸以利瘀血；地黃、白芍養(yǎng)血潤燥，緩中補虛，以助生新。甘草益氣和中，調和藥性，為佐使藥。

諸藥合用，祛瘀而不傷正，扶正而不留瘀。蟲類藥物，搜剔鉆透，直達病所，合用后破血逐瘀之力峻猛，瘀血重癥，非其不足以祛除。此方體現(xiàn)張仲景用藥嚴謹，寓意良深。

現(xiàn)代醫(yī)學認為血流緩慢、血液高凝和靜脈壁損傷是靜脈血栓形成三大因素[4]?？傄谎趸厦?TNOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)可引起血液高凝狀態(tài)。TNOS有三種亞型同功酶，包括神經元型一氧化氮合酶(nNOS)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS )以及iNOS，其中iNOS正常情況下在細胞內不表達，只有在損傷后誘導表達[5]。iNOS激活后活性持續(xù)時間長，可誘導持續(xù)大量釋放超出生理濃度的一氧化氮[6]，活性氮氧終產物生成增多，導致脂質過氧化，細胞壞死，釋放更多的炎性介質，從而易形成血栓?，F(xiàn)代藥理研究表明，蟄蟲中含有絲氨酸蛋白酶，可以激活人體血纖溶酶原。水蛭素有抗凝、抗血栓、抗血小板凝聚作用，促進新生血管的生成[7]，水蛭素和凝血酶結合后可抑制凝血酶上的纖維蛋白原結合位點，使纖維蛋白原不能轉變?yōu)槔w維蛋白，從而抑制凝血過程[8]。桃仁有抗凝作用，對血流阻滯、血行障礙有改善作用。

本研究中大黃蟄蟲丸能夠降低模型大鼠血清中的iNOS，升高血清中的TNOS含量。光鏡及電鏡下血栓模型組血管內皮不同程度破壞，但大黃蟄蟲丸能顯著改善其狀態(tài)，且高劑量組保護血管內皮比中、低劑量組明顯。上述實驗結果說明大黃蟄蟲丸有良好的預防血栓及保護內皮作用，為臨床應用提供了可靠的理論依據(jù)。

[1] KAHN S R,GINSBERG J S.The post-thrombotic syndrome:current knowledge,controversies,and direction for future research[J].Blood Rev,2002,16(3):515-165．

[2] HAENEN J H,JANSSEN M C,WOLLCRSHEIM H,et al.The development of postthrombotic syndrome in relationslup to venous reflux and calf muscle pump dysfunction at 2 years after the onset of deep venous thrombosis[J].J Vasc Surg,2002,35(6):1184-1189.

[3] BANTES C,NEWALL F,MONAGLE P.Post—thrombotic syndrome[J].Arch Dis Child,2002,86(3):212-241.

[4] 陳孝平,汪建平.外科學[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:518.

[5] 楊智明,方克偉.誘導型一氧化氮合酶/環(huán)氧合酶2在女性壓力性尿失禁中的研究進展[J].醫(yī)學研究生學報,2015,28(3):323-324.

[6] 鄭大同,李述庭,高雁翎,等.新生鼠缺氧后腦組織細胞結構型和誘生型一氧化氮合酶基因表達變化的研究[J].南京醫(yī)科大學學報,1999,19(5):368-370.

[7] 郭應信,殷國前,李佳荃.天然重組水蛭素對隨意皮瓣淤血模型血管內皮細胞生長因子的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復,2011,15(7):1210-1214.

[8] WEITZ J I,LESLIE B,HUDOBA M.Thrombin binds to soluble fibrin degradation products where it is protected from inhibition by heparin-antithrombin but susceptible to inactivation by antithrombin-independent inhibitors[J].Circulation,1998,97(6):544-552.