從HPT軸角度探討桂枝-附子在金匱腎氣湯中溫補腎陽的作用機理

戴冰，楊夢琳，張嘉妮，李玉星，周芳亮，肖子曾*

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208)

腎陽虛是指腎陽虛衰，命火不足，陰寒內(nèi)生，以腰膝酸軟、性欲減退、夜尿多[1]為主要臨床表現(xiàn)的一類虛寒癥狀?，F(xiàn)代研究表明，腎陽虛與神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)中下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸有密切關(guān)系，即腎陽虛患者通常表現(xiàn)為HPT軸功能紊亂[2]，故通過調(diào)節(jié)HPT軸可改善腎陽虛，從而達到溫補腎陽的目的。

金匱腎氣丸始見于張仲景的《金匱要略》，臨床上常用于腎陽虛引起的腎虛水腫，腰膝酸軟，小便不利等癥狀。該方在重用干地黃、山茱萸、山藥等補腎益精的藥物外，還配伍少量補陽之品桂枝、附子，意微微生火從而鼓舞腎氣[3]。但桂枝-附子二藥在金匱腎氣湯中如何起到溫補腎陽的作用，是否為該方改善腎陽虛的藥效物質(zhì)，目前這些方面的研究尚有不足。故本研究擬通過觀察金匱腎氣湯及桂枝-附子對HPT軸的影響，來探討桂枝-附子在金匱腎氣湯中溫補腎陽的作用機理，為解釋金匱腎氣湯“陰中求陽”的配伍關(guān)系提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料與儀器

1.1 藥物

按金匱腎氣湯(熟地黃24 g、山茱萸12 g、山藥12 g、澤瀉9 g、牡丹皮9 g、茯苓9 g、桂枝3 g、附子3 g)稱取原藥材2劑，再按金匱腎氣湯中桂枝-附子比例(桂枝3 g、附子3 g)稱取藥材2劑，所有飲片均購自于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。

1.2 動物

清潔級雌雄各半的昆明種小鼠(KM)60只，體質(zhì)量(20±2)g，均購自于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號SCXK(湘)2013-0004。

1.3 試劑

氫化可的松注射液(安陽九州藥業(yè)有限責任公司，批號140820001A)；小鼠環(huán)磷酸腺苷 (cAMP)、小鼠環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(R&D systems)；碘[125I]三碘甲狀腺原氨酸(T3)、碘[125I]甲狀腺素(T4)放射免疫分析藥盒(批號150820)、碘[125I]促甲狀腺激素(TSH)放射免疫分析藥盒(批號150820)(北京北方生物技術(shù)研究所)。

1.4 主要儀器

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；小型冷凍離心機(型號：centrifuge 5415R)；羅氏全自動生化儀(型號：Modular DPP)；Motic B5 顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團公司)；Shandon 325 型石蠟切片機(英國Shandon公司)。

2 方法

2.1 藥物制備

金匱腎氣湯及桂枝-附子兩組藥材中附子先煎60 min ，再加入其他藥材，分別加6倍量的水浸泡30 min后，煎煮2次，每次30 min，合并2次藥液后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至含生藥1.5 g/ml的濃縮液。

2.2 分組及給藥

取雌雄各半的KM小鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分成空白組、腎陽虛模型組、金匱腎氣湯組、桂枝-附子組，每組15只。分組后第2天開始，金匱腎氣湯組(10.53 g生藥/kg)、桂枝-附子組(0.78 g生藥/kg)按相應(yīng)劑量灌胃給藥，空白組及模型組每日灌胃蒸餾水，連續(xù)15 d。

2.3 腎陽虛模型的制備

在第6～15 d，小鼠在每日下午15時按照25 mg/kg劑量灌胃氫化可的松注射液，建立腎陽虛模型。空白組小鼠則灌胃蒸餾水。

2.4 標本采集與處理

各組大鼠末次給藥后禁食24 h，即實驗第16天摘眼球取血，并立即分離血清、血漿；并摘取甲狀腺組織將其置于10%甲醛溶液中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 指標檢測

2.5.1 癥狀觀察、體質(zhì)量測定

每日觀察并記錄小鼠日常癥狀，測量并記錄造模后小鼠體質(zhì)量的變化。

2.5.2 cAMP、cGMP含量測定

小鼠摘眼球取血后，將血液置于常溫下30 min，離心15 min(3 500 r/min)，收集上清液后按小鼠環(huán)磷酸腺苷 (cAMP)及小鼠環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒操作說明進行檢測。

2.5.3 T3、T4及 TSH含量測定

小鼠摘眼球取血后，將血液置于常溫下30 min，離心15 min(3 500 r/min)，收集上清液后按碘[125I]三碘甲狀腺原氨酸(T3)、碘[125I]甲狀腺素(T4)放射免疫分析藥盒及碘[125I]促甲狀腺激素(TSH)放射免疫分析藥盒操作說明進行檢測。

2.5.4 甲狀腺組織病理形態(tài)改變觀察

將各組小鼠甲狀腺均置于10%甲醛中固定，并經(jīng)過常規(guī)梯度脫水、二甲苯透明后，浸蠟、石蠟包埋，切片3～5 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色，并在常規(guī)顯微鏡下觀察各甲狀腺組織形態(tài)的變化。

2.6 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 對腎陽虛模型小鼠體質(zhì)量、癥狀的影響

與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量在造模后有顯著性差異(P<0.01)，且模型組小鼠還出現(xiàn)活動減少、反應(yīng)遲鈍，蜷曲拱背等癥狀。與腎陽虛模型組比較，金匱腎氣丸組體質(zhì)量有顯著性差異(P<0.01)，小鼠反應(yīng)靈活、毛發(fā)有光澤，少有蜷曲拱背現(xiàn)象出現(xiàn)。提示腎陽虛模型小鼠體質(zhì)量降低，金匱腎氣湯能改善模型小鼠腎陽虛癥狀，可使體質(zhì)量增加，而桂枝-附子則對其無影響。結(jié)果見表1。

表1 對腎陽虛模型小鼠體質(zhì)量的影響

注：與空白組比較，**P<0.01；與腎陽虛模型組比較，△△P<0.01

3.2 對腎陽虛模型小鼠血漿cAMP及cAMP/cGMP比值的影響

與空白組比較，模型組血漿cAMP及cAMP/cGMP比值有顯著性差異(P<0.01)；與模型組比較，金匱腎氣湯組、桂枝-附子組血漿cAMP及cAMP/cGMP比值有顯著性差異(P<0.01)。提示金匱腎氣湯和桂枝-附子均能抑制模型小鼠cAMP及cAMP/cGMP比值下降的趨勢。結(jié)果見表2。

表2 對腎陽虛模型小鼠血漿cAMP、cAMP/cGMP的影響

注：與空白組比較，**P<0.01；與腎陽虛模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3.3 對腎陽虛模型小鼠血清中T3、T4、TSH濃度的影響

與空白組比較，模型組血清中T3、T4及TSH濃度有顯著性差異(P<0.01)；與腎陽模型組比較，金匱腎氣湯組、桂枝-附子組血清中T3、T4及TSH濃度有顯著性差異(P<0.01)。表明模型小鼠血清中T3、T4及TSH濃度降低，提示金匱腎氣湯、桂枝-附子均能緩解模型小鼠血清中T3、T4及TSH濃度下降的趨勢。結(jié)果見表3。

表3 對腎陽虛模型小鼠血清TSH、T3、T4的影響

注：與空白組比較，**P<0.01；與腎陽虛模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3.4 對腎陽虛模型小鼠甲狀腺組織病理形態(tài)的影響

空白組可見該甲狀腺的濾泡為呈圓形、橢圓形，內(nèi)部為紅染膠質(zhì)，濾泡間未見水腫，上皮細胞無增生。模型組可見該甲狀腺濾泡上皮細胞不完整，大部分濾泡膠質(zhì)稀薄或缺失；金匱腎氣湯組可見該甲狀腺濾泡壁上皮細胞完整，濾泡未見腫大，內(nèi)部為紅染膠質(zhì)，無稀薄或缺失；桂枝-附子組濾泡壁上皮細胞完整，但大部分濾泡膠質(zhì)稀薄或缺失。提示模型小鼠甲狀腺組織受損，金匱腎氣湯能修復(fù)模型小鼠受損的甲狀腺組織，但桂枝-附子二藥修復(fù)作用不明顯。結(jié)果見圖1。

4 討論

cAMP、cGMP是調(diào)節(jié)細胞功能的既相互拮抗又相互制約的重要物質(zhì)[4]，對細胞功能處于穩(wěn)定狀態(tài)具有雙向調(diào)控作用，與中醫(yī)基礎(chǔ)理論中的“陰陽學說”有許多共同點。

研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)腎陽虛患者的血漿中cAMP含量降低，cAMP/cGMP比值下降，可以對腎陽虛模型進行評價[5]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣湯、桂枝-附子二藥均可使其血漿cAMP水平、cAMP/cGMP比值升高，改善腎陽虛證。

圖1 對腎陽虛模型小鼠甲狀腺組織形態(tài)學的影響(HE，10×40)

下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸是由下丘腦、垂體與甲狀腺組成的神經(jīng)內(nèi)分泌功能軸之一，調(diào)節(jié)著機體內(nèi)外環(huán)境之間的相互平衡[6]。該軸中下丘腦分泌的促甲狀腺激素釋放激素(TRH)通過一系列途徑使垂體門脈系統(tǒng)刺激腺垂體細胞分泌促甲狀腺激素(TSH)，而TSH是直接調(diào)節(jié)甲狀腺形態(tài)和功能的重要激素，其既可促進甲狀腺濾泡上皮細胞增生，又能促進T3和T4的合成與釋放，參與機體基礎(chǔ)代謝等多種功能活動[7]。而內(nèi)分泌系統(tǒng)功能障礙是虛證的重要表現(xiàn)之一，腎陽虛患者常表現(xiàn)為HPT軸功能抑制[8]，即表現(xiàn)為HPT軸中下丘腦分泌TRH與垂體分泌TSH減少，從而抑制甲狀腺濾泡釋放T3、T4。本研究發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣湯及桂枝-附子二藥均能上調(diào)甲狀腺濾泡分泌的T3、T4水平，升高HPT軸中垂體分泌的TSH水平。故桂枝-附子可能為金匱腎氣湯溫發(fā)揮補腎陽作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，該方的溫補腎陽的作用機制可能通過升高HPT軸中甲狀腺分泌的T3、T4和垂體分泌的TSH,從而改善腎陽虛證有關(guān)。

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