醒腦靜對(duì)Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制

李衛(wèi)萍， 杜菊梅， 張 磊， 申艷方， 陳向榮， 王 茹

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一類好發(fā)于70歲以上人群的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多表現(xiàn)為認(rèn)知障礙、精神及行為異常、生活工作能力退化等。在疾病進(jìn)展過程中，β-淀粉樣蛋白 (Aβ) 在人體內(nèi)大多以聚合物、單體及不溶性纖維存在，大腦中產(chǎn)生或沉積過量的Aβ會(huì)引發(fā)錯(cuò)誤的折疊，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，與退行性病變相關(guān)，同時(shí)過量的Aβ可激活一系列的病理事件(血腦屏障破壞、微循環(huán)變化)及炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞變性和死亡，是阿爾茨海默病發(fā)生的病理基礎(chǔ)[1]。目前阿爾茨海默病的治療主要是控制伴發(fā)的神經(jīng)、精神癥狀，包括使用一些抗焦慮、抗抑郁、抗精神病藥等以及使用益智類及改善認(rèn)知功能的藥物。醒腦靜作為腦代謝賦活藥物通過擴(kuò)張腦血管、增加腦皮質(zhì)細(xì)胞對(duì)氧及其他生物素的利用發(fā)揮作用[2]，醒腦靜注射液是在安宮牛黃丸的基礎(chǔ)上改制形成的水溶性注射液，包含了麝香、冰片、梔子、郁金等中藥成分[3]。麝香開竅，止痛，有破血化淤功效；冰片氣清香，味辛涼，主散郁火，能透骨熱，常與麝香配伍；梔子清熱，瀉火，涼血；郁金行氣解郁，清心涼血，有鎮(zhèn)靜、止血、消腫等作用[3]。醒腦靜的有效成分極易通過血腦屏障直接作用于神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)元發(fā)揮作用，常用于中風(fēng)昏迷、腦梗死、顱腦外傷及阿爾茨海默病的治療[4～6]，對(duì)腦組織起到保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)不同濃度醒腦靜對(duì)Aβ 25～35誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞凋亡模型的影響，初步探討醒腦靜治療阿爾茨海默病的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng) 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)在含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(含青霉素100 kU/L，鏈霉素100 μg /ml)，于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)于無菌孵箱，每2 d更換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，0.25%Trypsin-0.03%EDTA 消化傳代細(xì)胞。

1.2 Aβ的孵育 Amyloid β-Protein Fragment 25～35，系購(gòu)自sigma公司，使用1.8 ml重蒸水將1 mg Aβ 25～35溶解成濃度為500 μmol/L的母液，于37 ℃條件下孵育7 d以形成聚集形式的Aβ 25～35，根據(jù)要求制備工作液用于實(shí)驗(yàn)，母液-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 AD細(xì)胞模型構(gòu)建及醒腦靜實(shí)驗(yàn)分組 采用Aβ 25～35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞制備阿爾茨海默病凋亡細(xì)胞模型，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)的SH-SY5Y細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前1 d更換1%血清DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)處理，使細(xì)胞達(dá)到同步化狀態(tài)，去除血清、雙抗等其他因素對(duì)細(xì)胞的影響，24 h后給予濃度為：25 μmol/L的Aβ 25～35刺激，作用于細(xì)胞24 h，使SH-SY5Y細(xì)胞達(dá)到細(xì)胞凋亡模型狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)判斷造模是否成功。

醒腦靜實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組：SH-SY5Y細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；造模組：SH-SY5Y細(xì)胞加入終濃度為25 μmol/L的 Aβ 25～35培養(yǎng)24 h；Aβ 25～35+醒腦靜組：不同濃度的醒腦靜(2 ml/L、4 ml/L、8 ml/L)分別預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞3 h，隨后加入25 μmol/L的Aβ 25～35共同培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)胞形態(tài)的觀察 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)的SH-SY5Y細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，以(1～1.5)×106個(gè)/ml 的濃度接種于6孔板，每孔接種4 ml混勻的細(xì)胞懸液，分對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)前1 d給予無血清處理以排除血清及雙抗對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響，實(shí)驗(yàn)組加入Aβ 25～35使Aβ終濃度分別維持在0 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L，對(duì)照組加等量培養(yǎng)液，24 h后觀察Aβ 25～35對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的影響，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，記錄并拍照。

1.5 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)的SH-SY5Y細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，以(1～1.5)×104個(gè)/ml 的濃度接種于96孔板，每孔接種200 μl混勻的細(xì)胞懸液，分別設(shè)置5個(gè)副孔，去掉最大及最小的吸光度值所在副孔，其他三孔求平均值則為該組的吸光度值；設(shè)置1組為空白對(duì)照組，空白對(duì)照組只加培養(yǎng)液及MTT液，不接種細(xì)胞。接種96孔板5塊，分別在每天同一個(gè)固定時(shí)間向待檢測(cè)96孔板每孔加入20 μl，5 mg/ml MTT溶液，其余未檢測(cè)96孔板在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液。待檢測(cè)96孔板加入MTT液37 ℃，5% CO2孵育4 h后移去培養(yǎng)液，排槍每孔加入150 μl DMSO，在490 nm波長(zhǎng)下酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)各孔吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 不同處理組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，PBS漂洗3遍，收集細(xì)胞沉淀，加入固定液固定，調(diào)整細(xì)胞濃度為不少于1×106個(gè)/ml，使用Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blot法檢測(cè)bcl-2、bax水平 取處理48 h后不同組細(xì)胞，PBS沖洗后置于冰上裂解(含有cocktail的1*ripa裂解液)20 min，經(jīng)槍頭吹打后置于超聲裂解3 min，12000 r/min離心15 min，收集總蛋白，BCA法蛋白定量。取樣品50 μg進(jìn)行SDS-聚丙乙烯酰胺凝電泳，待轉(zhuǎn)至纖維素膜后，10%脫脂牛奶封閉1 h，一抗(Bcl-2抗體、Bax抗體)4 ℃過夜孵育，次日室溫復(fù)溫30 min后，TBST洗膜3～5次，每次3 min，室溫孵育二抗1 h，置于TBST中，洗膜3～5次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ25～35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡模型 分別給予SH-SY5Y細(xì)胞不同濃度Aβ 25～35[0(對(duì)照組)、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L Aβ 25～35]，使其作用于細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活情況(見圖1A)，電子顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，記錄并拍照(見圖1B)。結(jié)果可見：與對(duì)照組相比，隨著Aβ 25～35造模劑濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，在Aβ 25～35濃度為50 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率約為50%；顯微鏡觀察對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)呈梭形，核形規(guī)則，密度均勻，細(xì)胞數(shù)量較多，隨著Aβ 25～35造模劑濃度的增加，Aβ造模組細(xì)胞由梭形變?yōu)椴灰?guī)則方形，突起變短，同時(shí)細(xì)胞大小固縮且分布不均，細(xì)胞數(shù)目減少(見圖1B)。綜合Aβ 25～35對(duì)細(xì)胞的毒性及殺傷作用，結(jié)合查閱文獻(xiàn)，選定25 μmol/L為Aβ 25～35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡模型的最適宜濃度。經(jīng)25 μmol/L Aβ 25～35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞24 h后凋亡模型造模成功。

2.2 醒腦靜對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測(cè)不同濃度的醒腦靜(2 ml/L、4 ml/L、8 ml/L)對(duì)Aβ 25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：加入醒腦靜組細(xì)胞(Aβ 25～35+2 ml/L醒腦靜、Aβ 25～35+4 ml/L醒腦靜、Aβ 25～35+8 ml/L醒腦靜)的增殖情況較單純?cè)炷＝M細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)，并且隨著醒腦靜濃度的增加，其增殖水平逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)。說明醒腦靜可以通過促進(jìn)Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖拮抗Aβ 25～35誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有保護(hù)作用。

2.3 醒腦靜對(duì)Aβ 25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，Aβ 25～35造模組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，充分說明Aβ 25～35誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型構(gòu)建成功，同時(shí)Aβ 25～35+2 ml/L醒腦靜、Aβ 25～35+4 ml/L醒腦靜、Aβ 25～35+8 ml/L醒腦靜組SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率較造模組降低，并且隨著醒腦靜濃度的增加，細(xì)胞存活率增加，總體凋亡率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。說明醒腦靜可以抑制Aβ 25～35誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，其對(duì)Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

2.4 醒腦靜對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，Aβ 25～35造模組細(xì)胞Bcl-2含量明顯減少，Aβ 25～35誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型成功，抗凋亡蛋白Bcl-2含量隨著醒腦靜濃度的增加表達(dá)含量增加；與對(duì)照組相比Aβ 25～35造模組細(xì)胞Bax含量明顯升高，同時(shí)促凋亡蛋白Bax含量隨著醒腦靜濃度的增加表達(dá)含量下降，說明醒腦靜可以通過上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)和抑制Bax的表達(dá)，導(dǎo)致兩者比值失調(diào)，抑制Aβ 25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡過程，其對(duì)Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用(見圖4)。

圖1 Aβ25～35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡模型

圖2 醒腦靜對(duì)Aβ 25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響

3 討 論

阿爾茨海默病的特征性病理變化是細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成老年斑(SP)和細(xì)胞內(nèi)tau蛋白異常磷酸化導(dǎo)致神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)形成[7]?，F(xiàn)階段可通過Aβ 1～42、Aβ 1～40或Aβ 25～35淀粉樣蛋白刺激模擬AD老年斑形成構(gòu)建阿爾茨海默病研究模型[8，9]，Nestheide等[10]研究表明Aβ淀粉樣蛋白可通過誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax及P53等導(dǎo)致神經(jīng)元缺失。

研究證實(shí)，多種中草藥具有清除氧自由基和抑制炎癥反應(yīng)作用[11]，醒腦靜作為這一類醒腦開竅藥物的代表，可用于治療各類腦炎、腦病[12，13]。有研究證實(shí)醒腦靜注射液有十分明確的抑制腦缺血-再灌注損傷和防治腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用[14]。張煥等[15]在對(duì)認(rèn)知功能障礙大鼠的研究中證實(shí)醒腦靜注射液可增加海馬區(qū)nNOS表達(dá)、降低血清β-淀粉樣蛋白含量，從而保護(hù)海馬組織形態(tài)的完整性，改善老年認(rèn)知功能障礙大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

圖3 醒腦靜對(duì)Aβ 25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

圖4 醒腦靜對(duì)Aβ 25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括膜受體通路和線粒體通路這兩條，醒腦靜可對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)以減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，包括抑制凋亡誘導(dǎo)的啟動(dòng)、拮抗凋亡執(zhí)行蛋白酶活化和調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá)等[16，17]。細(xì)胞凋亡在促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的調(diào)控下發(fā)生，兩種蛋白相互拮抗維持動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用[18]。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2，由Bcl-2/Bax組成的異源二聚體形成動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)體系，其比率決定是否發(fā)生細(xì)胞凋亡，比值越低越容易發(fā)生細(xì)胞凋亡，Bcl-2及Bax這一動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)作為P53調(diào)控的重要靶點(diǎn)，組成了P53介導(dǎo)的線粒體依賴凋亡途徑[18，19]。本實(shí)驗(yàn)通過建立Aβ 25～35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡模型，給予不同濃度醒腦靜處理造模組細(xì)胞，探討不同濃度醒腦靜對(duì)Aβ 25～35誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞凋亡途徑的保護(hù)作用及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Aβ 25～35作用于SH-SY5Y細(xì)胞后引起了細(xì)胞凋亡，醒腦靜通過降低促凋亡蛋白的表達(dá)，提高抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步通過western blot的方法推測(cè)其通過作用于Bcl-2、Bax這類凋亡相關(guān)蛋白發(fā)揮保護(hù)作用。

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