利用赤霉素提高微藻耐酸性的研究

史飛飛，程宇嬌，馬浩天，程蔚蘭，宋程飛，李潤植

(山西農(nóng)業(yè)大學 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801)

工廠中化石燃料的燃燒是造成溫室效應的主要因素，因此工廠煙道氣中CO2的減排是緩解溫室效應的關(guān)鍵。國內(nèi)外有關(guān)專家針對CO2的減排提出很多方法，如利用物理化學方法進行吸收、捕集CO2用于工廠或封存等。而近年來利用生物減排取得很大進展，尤其是微藻固定CO2技術(shù)是目前世界上最主要和最有效的固碳方式之一，從長遠角度考慮，也是一種經(jīng)濟可行、環(huán)境友好和可持續(xù)性發(fā)展的CO2固定技術(shù)[1]。微藻的固碳效率是普通陸生植物的10～50倍，而且微藻具有生長周期短、適應環(huán)境能力強、不占用耕地面積等優(yōu)勢[2]。微藻還可以直接利用煙道氣中的碳源和氮源等作為其生長所需要的的營養(yǎng)原料，而且最后收集的藻體可以作為生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品和生物柴油的原料。Chae等[3]利用微藻固定煙道氣中的CO2的同時并生產(chǎn)富含高蛋白動物飼料,并取得很好的效果。 Israel等[4]利用煙道氣中CO2培養(yǎng)紅海藻，不僅固定了CO2而且使紅海藻培養(yǎng)成本大大降低。諸多應用微藻固定煙道氣CO2的研究表明利用微藻減排是一種經(jīng)濟可持續(xù)的措施。

利用微藻固定煙道氣中CO2對于控制全球的溫室效應具有重要的意義，但是也存在一定的局限性。來自電廠和煤炭企業(yè)的煙道氣中除含有較高的濃度的CO2外，SOx和NOx等酸性氣體的濃度也很高。當煙道氣通入培養(yǎng)液時會導致其pH急劇下降，進而影響微藻的生長和固碳效率，因此解決培養(yǎng)液酸化問題是順利進行微藻固定煙道氣中CO2的關(guān)鍵。Jiang等[5]利用空氣來稀釋煙道氣降低酸性氧化物的濃度，添加堿性物質(zhì)到培養(yǎng)液和通過pH反饋控制計來控制煙道氣的通入量等來降低培養(yǎng)液的酸化對微藻生長的影響。然而這些方法的應用增加了微藻固碳體系的成本或者降低了微藻利用煙道氣的效率，而且也不能從根本上解決培養(yǎng)液酸化對微藻生長的影響。要從根本上解決酸性環(huán)境對微藻生長的抑制作用，通過調(diào)控技術(shù)提高藻種耐酸性或培育抗酸性的微藻藻株是一個有效措施。孟范平等[6]從12種海洋微藻中篩選出了能夠耐酸性和耐高濃度CO2的小新月菱形藻和海水小球藻。Yue等[7]在電廠附近的水體中分離出一株藻株，可以在70% CO2下生存，具有良好的耐酸性。Jiang[8]通過酸馴化使得柵藻可以在pH 2.5的環(huán)境生存。

本試驗首先從藻種庫中篩選出一株耐酸性的藻種，然后通過添加一定量赤霉素來進一步提高該篩選藻種的耐酸性，試驗結(jié)果證明向培養(yǎng)液中添加一定量的赤霉素可以極大的提高微藻在低pH環(huán)境下的生長速率，也提高了微藻在極低pH的生存能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 微藻藻種

試驗所需要用到的藻種：小球藻、斜生柵藻、雨生紅球藻、三角褐指藻、微擬球藻、萊茵衣藻。其中，小球藻從山西農(nóng)業(yè)大學思想湖分離純化；斜生柵藻從山西一煤電廠附近水體采集的水樣分離純化；雨生紅球藻和萊茵衣藻從中國科學院水生所購買；三角褐指藻由中科院海洋所贈送；微擬球藻由山西大學謝樹蓮老師實驗室贈送。

1.1.2 培養(yǎng)基

小球藻、斜生柵藻、雨生紅球藻、微擬球藻和萊茵衣藻所用的培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基，配方組成為：NaNO31 500 mg·L-1，CaCl236 mg·L-1，K2HPO4·3H20 52.5 mg·L-1，Na2CO320 mg·L-1，MgSO436.6 mg·L-1，C6H8O76.6 mg·L-1，Na2EDTA·2H2O 1.1 mg·L-1，F(xiàn)eC6H5O7NH4OH 6 mg·L-1，H3BO32.86 mg·L-1，MnCl2·4H2O 1.81 mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.08 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.22 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.39 mg·L-1。三角褐指藻所用的培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基，配方組成為：NaNO375 mg·L-1，NaH2PO4·H2O 5 mg·L-1，Na2SiO3·9H2O 20 mg·L-1，Na2EDTA 4.36 mg·L-1，F(xiàn)eCl3·6H2O 3.16 mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.01 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.023 mg·L-1，CoCl2·6H2O 0.012 mg·L-1，MnCl2·4H2O 0.18 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.07 mg·L-1，維生素B1 0.1 μg·L-1，維生素B12 0.5 μg·L-1，生物素0.5 μg·L-1。

1.2 方法

1.2.1 標準培養(yǎng)條件

將處于對數(shù)生長期的200 mL種子藻(1 g·L-1)接種到裝有700 mL培養(yǎng)基的柱狀玻璃生物反應器中，溫度設(shè)置為25 ℃，二氧化碳濃度為1%，通氣速率為80 L·h-1，光照強度7 000 lx。

1.2.2 模擬煙道氣酸化條件

工廠排放的煙道氣存在運輸存放的困難，不利于試驗的進行。試驗采用模擬工廠煙道氣的組分來替代工廠排放的煙道氣，在100 L的鋼瓶中裝有15% CO2、150 mg·L-1NO、300 mg·L-1SO2和一定體積的N2。

1.2.3 赤霉素對微藻生長的試驗

按每升培養(yǎng)液添加0、5、10、15、25、30 mg 6個赤霉素濃度梯度，每個梯度設(shè)置3個重復。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有的實驗的數(shù)據(jù)表示3次重復實驗的平均值，并用SPSS軟件進行顯著性分析。。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藻株耐酸性的比較

為了先尋找一株耐酸性較強的藻株，把藻種庫中的6種藻種接種在初始pH 3的環(huán)境中，通過觀察其生長狀況來判斷其耐酸性。如圖1a所示，在初始pH 3條件下， 三角褐指藻、萊茵衣藻、紫球藻和雨生紅球藻的生長均受到明顯的抑制，幾乎不生長，而小球藻和柵藻雖在生長初期生長初期緩慢，但其后擺脫酸性的抑制從而可以正常生長。與小球藻相比較，柵藻在酸性條件下生長速率快，適應酸性環(huán)境能力強。圖1-b中顯示的是在初始pH 3條件下6種藻種的pH變化曲線，三角褐指藻、萊茵衣藻、紫球藻和雨生紅球藻的pH幾乎沒有變化。而柵藻的pH的回升速度最快，小球藻次之。因此，6種藻種中柵藻適應酸性環(huán)境的能力最強，在后期的試驗中以柵藻為模式藻來進一步提高其耐酸性。

圖1 6株不同藻株在初始pH 3.0下的生長曲線(a)及pH變化曲線(b)Fig.1 The growth curve (a)and the pH change(b) of six algal strains at initial pH of 3.0

2.2 酸性條件下赤霉素濃度對于柵藻生長的影響

圖2所示為不同赤霉素濃度下柵藻在初始pH 3.0環(huán)境下的生長和pH狀況。圖2-a所示，與未添加赤霉素的柵藻比較，大部分添加赤霉素的的柵藻在生長初期能更快的適應酸性環(huán)境。而未添加赤霉素的柵藻在生長初期有明顯的延滯期，在培養(yǎng)12 d時，添加赤霉素的柵藻的生物量明顯大于沒有添加赤霉素的柵藻。其中，添加10 mg·L-1赤霉素的柵藻在生長初期延滯期最短，在培養(yǎng)12 d時其生物量達到最大，其適應酸性的環(huán)境最強。但添加25 mg·L-1赤霉素的柵藻與0 mg·L-1的柵藻的生長并沒有明顯區(qū)別。由圖2-b所見，與沒有添加赤霉素的柵藻比較，添加5、10、15、20 mg·L-1赤霉素的柵藻的pH回升速度快，尤其是添加10 mg·L-1赤霉素的柵藻的pH回升速度最快，與對照差異極顯著(P<0.01)。

圖2 不同赤霉素濃度下柵藻在初始pH 3下的生長曲線(a)及pH變化(b)Fig.2 The growth curve (a)and the pH change(b) of Scenedesmus at different gibberellin concentrations

在初始pH 3的條件下，添加10 mg·L-1赤霉素的柵藻的生長速率最快，其pH回升速度最快，因此在后期的實驗中以10 mg·L-1濃度的赤霉素為初始濃度來提高柵藻的耐酸性。

2.3 模擬煙道氣環(huán)境及煙道氣環(huán)境下柵藻的生長狀況

為了解煙道氣在通入培養(yǎng)液時的培養(yǎng)液的酸性強度，將模擬煙道氣通入只含BG11的培養(yǎng)液中，測定BG11培養(yǎng)液pH。如圖3所示，在通入煙道氣10 h時pH就下降到3.5左右，15 h后pH穩(wěn)定在2.5左右。培養(yǎng)液的酸化正是由于煙道氣中高濃度的CO2和氮硫氧化物引起的，會嚴重影響微藻的生長。

圖3 通入模擬煙道氣導致培養(yǎng)液pH變化的曲線Fig.3 The pH change in medium aerated by the simulated flue gas

圖4 柵藻在初始pH 2.5 條件下的pH變化曲線(a)和生長曲線(b)Fig.4 The pH change (a)and the growth curve (b) of Scenedesmus at initial pH of 2.5

在上面試驗中我們篩選出以柵藻為模式藻種，對添加的赤霉素初始濃度進行了優(yōu)化即添加10 mg·L-1赤霉素。為了獲得適應煙道氣的藻種，將柵藻接種在初始pH 2.5的環(huán)境下進行培養(yǎng)。

由圖4-a所示，在初始pH 2.5的酸性環(huán)境中，未添加赤霉素和添加赤霉素的柵藻在培養(yǎng)初期其pH幾乎沒有明顯變化，差異不顯著(P≥0.05)。當培養(yǎng)到第4天開始，添加赤霉素的柵藻pH迅速回升，而未添加赤霉素的柵藻在整個培養(yǎng)周期都沒有太大變化，差異極顯著(P<0.01)。說明添加了赤霉素的柵藻有很強的pH調(diào)節(jié)能力。由圖4b所示，在pH 2.5 的酸性環(huán)境中，未添加赤霉素的柵藻的生長完全受到了抑制，而添加赤霉素了的柵藻雖在培養(yǎng)前3天生長緩慢，當?shù)降?天迅速生長。

3 討論與結(jié)論

工廠排放的煙道氣給環(huán)境造成了嚴重的傷害，利用微藻固碳技術(shù)是一種經(jīng)濟可行、環(huán)境友好和可持續(xù)性的CO2固定技術(shù)。而利用微藻介導生物固碳技術(shù)進行CO2減排在實際應用時卻存在局限性。煙道氣中含有高濃度的CO2和氮硫氧化物，通入培養(yǎng)液時會造成培養(yǎng)液急劇酸化，而培養(yǎng)液的pH是影響自養(yǎng)微藻生長和固定CO2效率的重要因素。Sung等[9]在25 ℃培養(yǎng)條件下研究了不同pH對于小球藻的影響，結(jié)果證明在pH 3.5的條件下微藻的生長就會受到抑制。劉琪[10]把柵藻接種在初始pH 3.6的培養(yǎng)液中，結(jié)果2 d后發(fā)現(xiàn)生物量沒有上升反而下降了60.6%，而且大部分藻細胞褪色開始死亡。由于煙道氣通入培養(yǎng)液導致培養(yǎng)液的pH下降到3以下，因此煙道氣引起培養(yǎng)液的酸化是制約微藻利用煙道氣生物固碳的主要原因。

為了克服煙道氣通入培養(yǎng)液造成的酸化問題，前人從藻種方面出發(fā)篩選出了耐酸性的藻種或者耐氮硫氧化物的藻種[11～13]，但這些藻株能夠適應的最大的SO2濃度是0.015%。而且煙道氣本身顯酸性不利于溶解在酸性培養(yǎng)液中，使得煙道氣的利用效率不高[14]。保證微藻生長的pH適宜環(huán)境是克服煙道氣導致培養(yǎng)液酸的有效途徑，前人通過一系列調(diào)控手段來使得培養(yǎng)液的pH既適宜微藻的生長又不阻礙煙道氣的溶解。蔣銀莉[15]通過向藻液中添加堿性物質(zhì)來中和酸，如碳酸鈣和氫氧化納。添加氫氧化鈉和碳酸鈣雖解決了基質(zhì)酸化的問題，但又存在局限性和其它問題。添加氫氧化納因為成本問題不可能大規(guī)模應用，而且會導致藻液產(chǎn)生高離子壓不利于微藻的生長[16，17]。而添加碳酸鈣在微藻后期的采收中又存在很大困難，如后期分離碳酸鈣和硫酸鈣沉淀。蔣銀莉還采用pH自動反饋機制來調(diào)節(jié)藻液的pH，通過控制煙道氣的進氣量從而控制pH。pH反饋控制雖是抑制藻液酸化的有效途徑，但其也降低了微藻對煙道氣的使用量。

本試驗首先從藻種庫中篩選一株耐酸性藻株，分別對小球藻、斜生柵藻、雨生紅球藻、三角褐指藻、微擬球藻和萊衣依藻進行耐酸性測試。將這6株藻分別接種在初始pH 3的環(huán)境中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柵藻的延滯期最短，生長最好，而其它5株藻受抑制比較嚴重(圖1)。柵藻雖然在生長初期延滯期最短，但是還存在一定程度的抑制。已有研究顯示, 培養(yǎng)液pH的變化與接入微藻的生長快慢存在一定的關(guān)系。微藻本身光合作用及其生長可調(diào)節(jié)藻液pH, 藻液pH的改變反過來也影響微藻的光合和生長過程。高文濤等[18]發(fā)現(xiàn)微藻光合作用中碳酸酐酶起催化作用, 并會產(chǎn)生OH-, 產(chǎn)生的OH-被輸送到細胞外, 導致藻液pH升高。因此本試驗期望通過添加赤霉素來促進柵藻的生長來調(diào)節(jié)pH,從而縮短生長初期的延滯期。然而赤霉素存在高濃度抑制生長和低濃度促進生長的情況，所以本試驗研究了在初始pH 3條件下不同赤霉素濃度對于柵藻的影響，結(jié)果證明添加10 mg·L-1赤霉素的柵藻pH回升速度最快，生長最快，延滯期最短(圖2)。

本研究的目的是為了使得微藻適應煙道氣通入藻液時的環(huán)境，于是通過模擬煙道氣通入培養(yǎng)基來判定其導致的酸性強度。試驗把模擬煙道氣通入培養(yǎng)液中，測得其pH在2.5左右，因此把柵藻和添加10 mg·L-1赤霉素的柵藻接種在初始pH 2.5的環(huán)境中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無添加赤霉素的柵藻在整個培養(yǎng)期生長和pH幾乎沒有變化，藻液在第2天就變白，而添加赤霉素的柵藻雖在培養(yǎng)初期生長緩慢，但是在pH慢慢回升后其生長速度加快(圖4)。

本研究從實際生產(chǎn)應用出發(fā)，以提高柵藻適應煙道氣通入藻液造成的低pH環(huán)境為目標，從而建立了通過添加一定濃度的赤霉素來提高柵藻的耐酸性的簡便方法。添加赤霉素能顯著增強微藻在接入低pH培養(yǎng)液的抗酸性能力，并且促進柵藻的生長和使藻液pH迅速上調(diào)，確保微藻固定煙道氣體系的正常運轉(zhuǎn)。

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