不同處理對打破野生黃花苜蓿種子硬實的效果研究

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(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010031；2.中國科學(xué)院內(nèi)蒙古草業(yè)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

硬實是種子休眠類型之一，是種皮或果皮不透水而抑制種子萌發(fā)的一種現(xiàn)象。硬實現(xiàn)象在植物中廣泛存在，其中最常見于豆科植物種子[1]。如紫花苜蓿(Medicagosativa)[2]、扁蓿豆(Melilotoidesruthenica)[3]、山野豌豆(Viciaamoena)[4]、菜豆(Snapbean)[5]、黃芪(Astragalus)[6]等。有關(guān)破除種子硬實的報道很多，其主要原理就是利用物理或化學(xué)等手段改變種皮透性，促使種子吸水，從而打破休眠。但眾多研究結(jié)果表明，不同方法對不同植物種子的處理效果不同，因此不同物種破除硬實的方法應(yīng)視情況確定[7]。

黃花苜蓿(MedicagofalcataL.)是豆科苜蓿屬多年生草本植物，其草質(zhì)優(yōu)良，營養(yǎng)豐富，粗蛋白含量高，具有抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐牧性等特點，適宜在干旱、寒冷地區(qū)生長，是我國北方高寒地區(qū)天然草地中重要的優(yōu)良豆科牧草[8-10]。同時，由于它能夠與紫花苜蓿進(jìn)行雜交，被作為苜蓿屬育種中的重要抗性基因源，用于培育豐產(chǎn)、多抗的苜蓿品種[8,11-12]。黃花苜蓿種子雖小，但硬實現(xiàn)象比較嚴(yán)重。有研究表明，自然狀態(tài)下黃花苜蓿種子的發(fā)芽率從0～40%不等，平均發(fā)芽率僅為16.9%，二倍體種子的自然發(fā)芽率為0[13]，應(yīng)用前需做硬實破除處理。因此，本試驗分別采用機械、藥劑和溫度共6種處理方法對錫林浩特野生黃花苜蓿種子進(jìn)行硬實破除研究，旨在選出既能破除硬實種子又不影響種子正常萌發(fā)的方法，為黃花苜蓿的后期應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃花苜蓿種子于2015年采集于錫林浩特。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子基本性狀

隨機選取籽粒飽滿的野生黃花苜蓿種子20粒，利用光學(xué)顯微鏡觀察種子顏色、形狀；利用游標(biāo)卡尺測定種子的長度和寬度；利用萬分之一天平測定種子千粒重。

1.2.2 物理方法處理種子

1) 機械處理。磨擦處理：取一定量飽滿干凈的種子，利用砂紙打磨，直至種子表面失去光澤、出現(xiàn)砂劃的痕跡，進(jìn)行萌發(fā)試驗；劃破種皮處理：取一定量飽滿干凈的種子，利用手術(shù)刀片從種子背面劃破種皮，注意在處理過程中不得傷胚，處理完進(jìn)行萌發(fā)試驗。

2) 溫度處理。熱水浸種處理：將一定量飽滿干凈的種子分別置于溫度為60，70，80，90，100 ℃水中，待水自然冷卻到室溫，取出進(jìn)行萌發(fā)試驗；液氮處理：將一定量飽滿干凈的種子分別置于液氮中處理5，10，15，20 min，取出進(jìn)行萌發(fā)試驗。

1.2.3 化學(xué)方法處理種子

1) 濃硫酸處理。將一定量飽滿干凈的種子放入小燒杯中，利用98%的濃硫酸溶液分別處理種子5，10，15，20，30，40，50 min，用玻璃棒攪拌，使種子充分接觸硫酸溶液，達(dá)到處理時間后，立即取出用蒸餾水反復(fù)沖洗直至將硫酸完全去除，進(jìn)行萌發(fā)試驗。

2) 高錳酸鉀處理。將一定量飽滿干凈的種子放入100 mL的三角瓶中，利用濃度為0.3%的KMnO4溶液分別處理1，2，4 h和6 h，期間不斷搖晃三角瓶，使種子充分接觸溶液，達(dá)到處理時間后，取出用蒸餾水沖洗干凈，進(jìn)行萌發(fā)試驗。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗

將處理后的種子均勻擺放于鋪有2層濾紙直徑為90 mm的培養(yǎng)皿上，置于12 h/12 h(光/暗)，溫度為(25±2)℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)試驗，4 次重復(fù)，每重復(fù)50粒種子，并設(shè)置對照(未做任何處理，ck)。第 4天初次計數(shù)，第 14 天統(tǒng)計正常幼苗數(shù)和硬實種子數(shù)，計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率和硬實率。

發(fā)芽勢(%) =第4天正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽率(%) =14 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

硬實率( %) =第14天未吸脹的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗中所有數(shù)據(jù)均采用Excel軟件進(jìn)行基本處理，用SAS(One-way ANOVA)軟件進(jìn)行單因素顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子形態(tài)特征

種子表面呈現(xiàn)黃色或黃褐色，卵狀橢圓形，種子長(2.04±0.080 0)mm、寬(1.41±0.070 0)mm，千粒重為(1.430 1±0.030 5)g。

2.2 機械處理對黃花苜蓿種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和硬實率的影響

從表1可以看出，未經(jīng)處理的黃花苜蓿種子發(fā)芽勢為2.50%，發(fā)芽率為7.50%，硬實率高達(dá)91.00%，說明錫林浩特野生黃花苜蓿種子在自然狀態(tài)下存在著嚴(yán)重的硬實現(xiàn)象。但經(jīng)過砂紙打磨和切割處理后，黃花苜蓿種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均顯著高于對照 (p<0.05)(表1)。砂紙打磨和切破種皮經(jīng)處理的種子發(fā)芽勢比對照分別顯著提高了78.00%和92.50%，發(fā)芽率分別顯著提高了85.5%和91.00%。切割處理方法的種子硬實率降為0，硬實完全被破除，砂紙打磨的硬實率顯著下降到4.00%。

表1 機械處理對黃花苜蓿種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和硬實率的影響

注：不同小寫字母表示在0.05水平下差異顯著。下同。

2.3 熱水浸種處理對黃花苜蓿種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和硬實率的影響

經(jīng)過熱水浸種處理的黃花苜蓿種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率及硬實率結(jié)果見表2。隨著處理溫度的升高，發(fā)芽勢和發(fā)芽率也呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，而硬實率逐漸下降。方差分析結(jié)果顯示，當(dāng)浸種溫度在90，100 ℃時，發(fā)芽勢及發(fā)芽率顯著高于對照(p<0.05)，硬實率顯著下降(p<0.05)。100 ℃的熱水浸泡對黃花苜蓿種子硬實有較好的軟化作用，硬實率下降到8.50%，但從表2可以看出，22.5%吸脹的種子未萌發(fā)，說明100 ℃熱水浸泡對種子有一定的傷害；90 ℃水軟化種皮的效果雖然不如100 ℃的，但是發(fā)芽率和發(fā)芽勢也顯著高于對照(p<0.05)；80 ℃浸泡可顯著降低種子的硬實率，但對提高發(fā)芽率無顯著作用。60 ℃和70 ℃浸泡對硬實種皮軟化效果最差，發(fā)芽勢及發(fā)芽率與對照相比均無顯著變化(p>0.05)。這一結(jié)果表明，在一定的溫度范圍內(nèi)，浸種溫度越高，對打破種子的硬實、提高發(fā)芽率作用越顯著，但對種子自身傷害也較大。

表2 高溫處理對種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率及硬實率的影響

2.4 液氮處理對黃花苜蓿種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和硬實率的影響

由表3可以看出，與對照相比，經(jīng)過液氮處理不同時間黃花苜蓿種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和硬實率均發(fā)生顯著的變化。液氮處理5 min，發(fā)芽率可達(dá)59.00%，硬實率顯著下降到37.50%，隨著處理時間的延長，硬實率顯著下降，當(dāng)處理時間達(dá)到20 min時，硬實率顯著降低到25.00%，但發(fā)芽率也顯著降低到44.00%(p<0.05)。同時在萌發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過液氮處理后，部分萌發(fā)幼苗的胚根出現(xiàn)不同程度的斷裂。由此可見，液氮處理雖然能破除該品系種子的硬實，提高發(fā)芽率，但對種子傷害也較大，使大量種子不能萌發(fā)成為正常的幼苗。

表3 液氮處理對種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率及硬實率的影響

2.5 濃硫酸處理對黃花苜蓿種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和硬實率的影響

濃硫酸是具有腐蝕性的強酸，通過濃硫酸處理，可以破壞種皮堅硬的結(jié)構(gòu)，提高種子透水性，提高發(fā)芽率。由表4可以看出，與對照相比，黃花苜蓿種子經(jīng)過濃硫酸處理5～50 min，發(fā)芽勢、發(fā)芽率及硬實率均呈現(xiàn)出顯著的變化，發(fā)芽率顯著升高到85%以上，硬實率顯著降低到13%以下(p<0.05)。隨著浸種時間的延長，發(fā)芽勢及發(fā)芽率逐漸升高，30 min后隨著浸種時間的增加，發(fā)芽率和發(fā)芽勢開始下降，除浸種處理5 min外，發(fā)芽率與其他處理時間無顯著差異，均達(dá)到95%以上，硬實率均下降到10%以下，浸種時間達(dá)到20 min后，種子硬實被完全破除。浸種時間達(dá)到40 min后，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)的幼苗根系開始出現(xiàn)變短的現(xiàn)象，表明長時間的濃硫酸處理對種子產(chǎn)生了一定的傷害。因此，從發(fā)芽率和幼苗生長情況考慮，濃硫酸處理15～20 min被認(rèn)為是打破黃花苜蓿種子硬實的最佳時間段。

表4 濃硫酸處理對種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率及硬實率的影響

2.6 高錳酸鉀處理對黃花苜蓿種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和硬實率的影響

由表5可見，與對照相比，經(jīng)0.3%高錳酸鉀溶液浸泡1～6 h對黃花苜蓿種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率及硬實率均無顯著影響(p>0.05)。表明低濃度的高錳酸鉀在規(guī)定時間內(nèi)對破除黃花苜蓿種子硬實，提高發(fā)芽率無顯著作用。

表5 高錳酸鉀處理對種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率及硬實率的影響

3 討論與結(jié)論

硬實是由于種殼的機械壓制或由于種(果)皮不透水、不透氣阻礙胚的生長而表現(xiàn)的休眠現(xiàn)象，是植物界普遍存在的一種特性，硬實種子從其外部形態(tài)很難確定。本試驗供試種子為采集于錫林浩特區(qū)域的野生黃花苜蓿種子，發(fā)芽率僅為7.50%，硬實率高達(dá)91.00%，屬于典型的硬實性種子，不能直接用于試驗研究，在應(yīng)用前須采取一定的措施(如打磨、熱水處理、酸蝕等) 進(jìn)行硬實破除處理。

機械處理是通過人工或機械的外力使硬實種子種皮受損，進(jìn)而增強透性，解除種皮限制的一種方法。許多研究均表明，機械損傷種皮是處理硬實種子最直接有效的方法[4-15]。本試驗所采用的切割和砂紙打磨2種處理方法對打破黃花苜蓿種子硬實，提高發(fā)芽率效果顯著，發(fā)芽率分別顯著提高了85.5%和91.00%，硬實率降低到5%以下。但由于這2種方法耗時耗力，因此應(yīng)根據(jù)研究中所需種子的數(shù)量而定。種子數(shù)量少時，可以采用以上2種方法。

化學(xué)處理方法中濃硫酸是打破種子硬實最常用的一種試劑。由于濃硫酸的強酸性能夠腐蝕種皮，打破柵欄組織的屏障，使種殼變薄并消除珠孔等部位的堵塞物，增大種皮透性[16-17]，被認(rèn)為是硬實種子尤其是野生植物種子處理常用的方法[18]。濃硫酸處理在破除種子硬實上效果顯著，例如用它處理山野豌豆、敖漢苜蓿(Medicagesativacv.Aohan)、菜豆、兩型豆(AmphicarpaeaedgeworthiiBenth.)等種子，能使發(fā)芽率分別提高到99.33%、99%、98%和99.3%，但不同牧草種子對不同硫酸濃度和處理時間的反應(yīng)不同[4,16,19-20]。本研究中，濃硫酸處理5～50 min，均顯著提高了種子的發(fā)芽率(≥86%)，隨著時間的延長，30 min后萌發(fā)率開始呈現(xiàn)下降的趨勢，并且萌發(fā)幼苗根系出現(xiàn)變短的現(xiàn)象，未萌發(fā)種子死亡。這可能是由于濃硫酸處理時間過長傷及到種子，使種子活力減弱或失去活力。因此，選擇適宜的處理時間應(yīng)以破壞種皮結(jié)構(gòu)而不傷及種子活力為最佳處理時間，本試驗中綜合考慮硬實破除情況及對幼苗的影響，認(rèn)為處理15～20 min是較適宜的處理時間。

熱水浸種破除種子硬實被認(rèn)為是一種經(jīng)濟(jì)、簡單、效果較好的方法。熱水浸種可軟化種皮，改善種子的透氣性，從而解除由種皮造成的休眠，促進(jìn)萌發(fā)。但不同種子破除硬實的適宜溫度不同，浸種時間與種子大小、種皮厚薄及水溫有一定的關(guān)系[21]。黃花苜蓿種子隨著浸種溫度的升高，發(fā)芽率和硬實率均發(fā)生顯著變化，說明熱水浸種對解除硬實休眠促進(jìn)發(fā)芽有一定的作用，但在研究中發(fā)現(xiàn)，100 ℃浸種雖然可以有效地消除種子硬實，但也損傷了部分種子，60～80 ℃浸種雖然對種子不會產(chǎn)生損傷作用，但達(dá)不到打破種子休眠的目的。因此，在本研究中熱水浸種并不是破除硬實的理想方法。

適當(dāng)?shù)牡蜏乩鋬鎏幚砟軌蚩朔N皮的不透性，增進(jìn)種子內(nèi)部的新陳代謝，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)。黃花苜蓿種子在液氮中放置5～20 min，均能不同程度的打破種子的硬實，提高發(fā)芽率。但在研究中發(fā)現(xiàn)，不同液氮處理時間下部分吸脹的種子未萌發(fā)，而萌發(fā)的幼苗部分為不正常的幼苗。類似現(xiàn)象在液氮處理的扁蓿豆、苦豆子等種子硬實中也有報道[3，22]。但也有研究表明，經(jīng)液氮處理后的紫花苜蓿種子硬實率顯著降低，發(fā)芽率升高，且對種苗活力(以干重為指標(biāo))沒有影響[23]。造成這種現(xiàn)象的原因可能是因為物種間種皮厚度、結(jié)構(gòu)等不同，也可能是因為試驗中種子未經(jīng)預(yù)冷凍處理直接投放液氮中，或取出后未經(jīng)解凍，進(jìn)而對種子造成了一定傷害，但具體原因還需進(jìn)一步的研究。

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