乙烯利和SNP對花楸樹胚胎休眠解除的影響

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(東北林業(yè)大學林學院，林木遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

花楸樹(Sorbuspohuashanensis)，為薔薇科(Rosaceae) 蘋果亞科(Maloideae) 花楸屬(Sorbus)落葉小喬木，具有很高的觀賞價值、經(jīng)濟價值和藥用價值[1]。但由于野生花楸樹數(shù)量較少，種子具有深休眠特性，存在采種困難，種子發(fā)芽率低等問題，進而影響苗木的大量快速繁殖[2]。為了解決苗木供應問題，一些學者試圖利用嫁接[3]、扦插[4]和組培[5]的方法解決該問題。雖然取得一些進展，但遠遠不能滿足生產(chǎn)的需要。因此實踐中花楸樹的繁殖仍然以有性繁殖為主[6]。楊玲等研究發(fā)現(xiàn)，花楸樹種子經(jīng)過低溫2～5 ℃層積才能萌發(fā)，新種子解除休眠最短層積時間是120 d，陳種子是105 d[7]。吳超研究發(fā)現(xiàn)，花楸樹種子胚休眠的主要原因是胚內(nèi)存在萌發(fā)抑制物質，其中之一是ABA；用1 500 mg/L GA3預處理種子結合催芽處理可以促進種子萌發(fā)[8]。楊玲等[9]利用200 mg/L 6-BA浸種花楸樹種子并且在25 ℃/5 ℃變溫下萌發(fā)，可以縮短萌發(fā)起始時間，提高萌發(fā)率和發(fā)芽勢。

目前國內(nèi)外關于NO和乙烯對于種子萌發(fā)的影響已有報道。最常用到的NO供體是硝普鈉(SNP Sodium Nitroprusside)。Bethke[10]利用SNP處理擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子能夠促進種子解除休眠和萌發(fā)。宋要強等研究發(fā)現(xiàn)，用10 mmol/L SNP能夠有效地打破杜梨(Pyrusbetulifolia)種子的休眠，促進種子萌發(fā)，萌發(fā)率達到56.7%[11]。說明NO作為一種信號物質參與了種子萌發(fā)過程。但是對于NO如何通過信號轉導調節(jié)胚胎內(nèi)NO的代謝，促進種子萌發(fā)還不清楚。

乙烯是植物五大激素之一，在植物生長發(fā)育過程中起調節(jié)作用[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，乙烯對花生(Arachishypogaea)、蘋果(Maluspumila)和向日葵(Helianthusannuus)種子的萌發(fā)有促進作用[13]。徐小玉等[13]用150 mg/L乙烯利處理美女櫻(Verbenahybrid)種子，促進了種子的萌發(fā)和幼苗的生長。關于乙烯作用機理，有人認為，乙烯通過抑制脫落酸(ABA)對組織的作用，進而降低ABA的信號在種子休眠中的作用[15]；也有人認為，乙烯通過與其受體結合進而促進了赤霉素(GA)的活性[16]。植物種子的萌發(fā)是一個復雜的生理過程，受到多種因素的限制。關于NO和乙烯在更多植物種子休眠解除中的作用尚不明確，需要進一步深入研究。

本研究以花楸樹成熟合子胚胎為試驗材料，利用外源一氧化氮供體硝普鈉(SNP)、乙烯利以及SNP與乙烯抑制劑(NBD)組合處理花楸樹胚胎，觀察并記錄胚胎萌發(fā)情況，分析各處理對花楸樹胚胎萌發(fā)的影響，期望找到快速解除花楸胚胎休眠的有效方法，為進一步解釋NO和乙烯在解除花楸樹種子相互作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 萌發(fā)試驗

1.1.1 試驗材料

試驗所用材料取自黑龍江省五常市山河屯林業(yè)局鳳凰山林場(44°15′N，127°54′E)。采種時間2011年9月18日，共采集10株野生成熟花楸母樹的種子，將采集后的花楸樹果實分別進行人工調制(水選法)，將調制后獲得的種子置于4 ℃冰箱中留存、備用。

裸胚獲得方法：參照楊玲等[17]的研究方法。

1.1.2 萌發(fā)試驗方法

1) 乙烯利處理試驗。將胚胎放在經(jīng)3 mL(濃度為20 mmol/L)乙烯利溶液浸濕的濾紙上吸脹。對照不經(jīng)過任何處理，直接在蒸餾水浸濕的濾紙上吸脹。胚胎在培養(yǎng)室內(nèi)25 ℃、光照(每天16 h光照，光照強度50μmol/(m2·s)下萌發(fā)，對照和處理各設3個重復。

2) SNP處理試驗。NO熏蒸胚胎方法參照楊玲等[17]的研究方法，將剝離好的胚胎放在一個500 mL的大燒杯里，然后在大燒杯內(nèi)放置另外一個內(nèi)含5 mL濃度為2 mmol/L的SNP溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)的小燒杯，最后用保鮮膜將大燒杯的口封好，自然光、室溫下熏蒸3 h。處理后，用蒸餾水沖洗胚胎并放置在用蒸餾水浸濕的濾紙上。對照同上，萌發(fā)條件同上。

3) SNP與NBD的組合處理試驗。將胚胎在2 mmol/L SNP溶液的蒸汽中處理(預處理同上) 3 h后，在含有3 mL(1 mmol/L)NBD溶液浸濕的濾紙上吸脹。對照同上，萌發(fā)條件同上。

1.1.3 計算公式

1) 胚胎萌發(fā)率(%)=胚胎萌發(fā)粒數(shù)/供試胚胎總數(shù)×100%；

2) 平均發(fā)芽速度、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢的計算參照《林木種苗學實驗教程》[18]。

1.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

應用Excel 2003軟件對文中數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)的方差分析和多重比較應用SPSS 21.0 軟件進行，使用Sigma Plot 12.0軟件對數(shù)據(jù)作圖。文中的所有表格數(shù)據(jù)和圖中數(shù)據(jù)均為各重復處理的平均數(shù)±標準差。標準差是由每個處理的3次重復測量值計算出來的。采用方差分析評價試驗中各影響因素的作用，并在p=0.05水平上進行了顯著性檢驗。平均數(shù)間統(tǒng)計學差異用鄧肯多重比較法在p=0.05顯著性水平上檢驗。

2 結果與分析

2.1 乙烯利和SNP對花楸樹胚胎萌發(fā)的影響

不同處理對花楸樹胚胎萌發(fā)率的影響如圖1所示。由圖1可知，不同處理的花楸樹胚胎萌發(fā)率呈逐漸增加趨勢，至培養(yǎng)第7天和第8天保持不變，且各處理與對照均有顯著性差異(p<0.05)。乙烯利處理后的胚胎在培養(yǎng)的第2天即可萌發(fā)，早于其他處理(第3天開始萌發(fā))，且萌發(fā)率顯著高于其他處理。在第7天時，乙烯利處理的胚胎萌發(fā)率達到最大值(75.56%)，比對照高出41.67%；而SNP與NBD的處理組合萌發(fā)百分率(31.11%)最低。

2.2 乙烯利和SNP對花楸樹胚胎平均發(fā)芽速度的影響

平均發(fā)芽速是反應種子發(fā)芽快慢的指標。由圖2可知，各處理的平均發(fā)芽速度是呈先增加后降低的趨勢，且各處理與對照均有顯著性差異(p<0.05)。乙烯利處理花楸樹胚胎平均發(fā)芽速度在第1天以后就顯著高于其他處理，且在第4天時，平均發(fā)芽速度達到最大值(0.128)，比對照高出155.56%。SNP與NBD處理組合的平均發(fā)芽速度在第6天達到最大值(0.052)，比對照低46.43%。

圖1 乙烯利和SNP對花楸樹胚胎萌發(fā)率的影響

圖2 乙烯利和SNP對花楸樹胚胎平均發(fā)芽速度的影響

2.3 乙烯利和SNP對花楸樹胚胎發(fā)芽指數(shù)的影響

由圖3可知，各處理的發(fā)芽指數(shù)呈逐漸增加趨勢，至培養(yǎng)第7天和第8天保持不變，且各處理與對照均有顯著性差異(p<0.05)。乙烯利處理花楸樹胚胎發(fā)芽指數(shù)從第1天開始迅速上升，在第7天時達最大(6.40)，比對照高97.72%。而SNP與NBD處理組合的發(fā)芽指數(shù)在第6天時達最大(1.98)，比對照低63.31%。

圖3 乙烯利和SNP對花楸樹胚胎發(fā)芽指數(shù)的影響

2.4 乙烯利和SNP對花楸樹胚胎發(fā)芽勢的影響

各處理對花楸樹胚胎發(fā)芽勢的影響如圖4。由圖4可知，與對照均有顯著性差異。SNP處理的胚胎發(fā)芽勢最大(25.56%)，顯著高于其他處理。SNP與NBD處理組合的發(fā)芽勢最低(14.44%)，比對照低30.77%。

圖4 乙烯利和SNP對花楸樹胚胎發(fā)芽勢的影響

3 結論與討論

3.1 外源乙烯對花楸樹胚胎萌發(fā)的影響

種子萌發(fā)是生物體內(nèi)一系列化學反應和激素含量變化等復雜生理變化產(chǎn)生的結果。乙烯利是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的植物生長調節(jié)劑，乙烯在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用。研究結果發(fā)現(xiàn)，乙烯利處理后的花楸樹胚胎的萌發(fā)率、平均發(fā)芽速度、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢顯著高于對照。乙烯利處理花楸樹胚胎2 d后即可萌發(fā)，早于其他處理(第3天開始萌發(fā))，并且在第7天時，萌發(fā)百分率達到最高(75.56%)，比對照高出41.67%。結果表明乙烯對于種子萌發(fā)具有促進作用。這與莫云榮等[19]研究結果一致。有研究發(fā)現(xiàn)，乙烯和ABA在種子萌發(fā)和休眠過程中存在相互拮抗作用，ABA促進和維持種子休眠，抑制種子萌發(fā)[20-21]。乙烯利處理促進種子萌發(fā)的原因可能是外源添加乙烯增加了乙烯的含量，抵消了種子內(nèi)源激素ABA的作用，進而促進了種子的萌發(fā)。但Leubner-Metzger G等研究發(fā)現(xiàn)，乙烯并不能解除煙草(Nicotianatabacum)種子休眠，促進其萌發(fā)[22]。這點與本試驗結果不一致，原因是煙草種子休眠方式與花楸樹胚胎不同。另外，莫云榮等研究發(fā)現(xiàn)，乙烯對辣椒(Capsicumannuum)種子萌發(fā)的效果具有濃度效應，高質量濃度的乙烯對種子的萌發(fā)有抑制作用，低質量濃度的乙烯對種子萌發(fā)有促進作用[19]。乙烯雖然在種子萌發(fā)過程中具有重要的作用，但是乙烯的信號轉導途徑和作用機制還不清楚。

3.2 外源NO對花楸樹胚胎萌發(fā)的影響

NO是一種水溶性和脂溶性的氣體小分子。NO作為一種關鍵的信號分子在植物生命活動和新陳代謝過程中發(fā)揮作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，SNP處理后的花楸樹胚胎的萌發(fā)率、平均發(fā)芽速度、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢顯著高于對照。SNP處理增加了花楸樹胚胎的萌發(fā)百分率，比對照高出20.83%。說明NO對花楸樹胚胎萌發(fā)具有促進作用。這與SNP處理擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子[24]、蘋果(Maluspumila)種子[25]，打破休眠促進萌發(fā)的結果相一致。楊玲等研究發(fā)現(xiàn)，SNP預處理花楸樹胚胎可以削弱ABA對胚胎萌發(fā)的抑制作用[17]。推測SNP通過產(chǎn)生細胞內(nèi)NO作為重要的信號分子參與了ABA的代謝活動。SNP與NBD處理組合萌發(fā)百分率(31.11%)最低，NBD作為一種乙烯受體抑制劑，抑制內(nèi)源乙烯與其受體的結合，進而抑制乙烯對胚胎萌發(fā)的作用。SNP與NBD的處理組合對花楸樹胚胎的萌發(fā)效果顯著低于對照，這說明SNP產(chǎn)生的NO 不能緩解NBD對花楸萌發(fā)的抑制作用，推測NO的作用位點在NBD作用位點的上游。Gniazdowska 等研究發(fā)現(xiàn)，NO通過產(chǎn)生乙烯來打破蘋果種子胚的休眠，NO清除劑可以逆轉這種作用，乙烯合成抑制劑(AOA)可使NO處理過的胚不萌發(fā)，NO在乙烯的上游起作用[26]。這與本研究結果一致。楊玲等研究發(fā)現(xiàn)，SNP短期預處理可以促進花楸樹胚胎的萌發(fā)，但是NO對于花楸樹胚胎的萌發(fā)具有濃度效應，過多的NO 會抑制胚胎萌發(fā)，NO對花楸樹胚胎萌發(fā)具有濃度效應[17]。這與乙烯的作用效果相似。可能是NO通過產(chǎn)生乙烯，乙烯與其受體結合抑制ABA作用，進而調控種子的萌發(fā)，并且NO位于乙烯與ABA的上游。關于NO的作用機制還需進一步的研究。

乙烯和NO作為植物體內(nèi)重要的激素和信號分子在植物生長發(fā)育過程中起重要的調節(jié)作用。通過本研究可知： 1) 適宜濃度的乙烯和NO對花楸樹胚胎萌發(fā)具有促進作用；2) SNP處理不能緩解NBD對花楸樹胚胎萌發(fā)的抑制作用。證明NO的作用位點在NBD作用位點的上游。本研究對NO和乙烯促進花楸樹胚胎萌發(fā)機理問題進行了初步探索，為進一步解釋NO和乙烯在解除花楸樹種子相互作用機制奠定了基礎。

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