貴州金蕎麥種質(zhì)資源遺傳多樣性ISSR研究

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(貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550005)

金蕎麥(Fagopyrumdibotrys(D.Don)Hara)系蓼科蕎麥屬多年生草本植物，主要分布于我國長江流域的各省區(qū)，貴州省海拔250～2 900 m的地域皆有分布，是一種營養(yǎng)豐富并具有藥用價(jià)值的資源植物[1]，貴州省畜牧獸醫(yī)研究所于2012年選育出省級(jí)審定黔金蕎麥1號(hào)優(yōu)質(zhì)牧草品種，其生育期200 d，株高100～150 cm，直立莖，莖粗0.5～0.8 cm，單葉互生，葉片三角形，長與寬近似相等為6～11 cm，瘦果呈三棱形、長5 mm，種子千粒重為45～51 g，風(fēng)干物質(zhì)中主要包含粗蛋白質(zhì)、粗纖維、中性和酸性洗滌纖維，含量分別為22.72%，13.51%，29.10%，17.3%[2]。平均干草產(chǎn)量15 475 kg/hm2，刈割和青貯皆宜[3-4]。

近十幾年來，分子標(biāo)記被成功應(yīng)用在植物遺傳研究中，利用該技術(shù)可以對(duì)種質(zhì)間演化關(guān)系進(jìn)行理解，并以此對(duì)栽培植物品種的分類進(jìn)行指導(dǎo)。目前已有多種DNA分子標(biāo)記技術(shù)成功應(yīng)用于植物遺傳多樣性研究中[5]。

ISSR(inter-simple sequence repeat) 即簡單序列重復(fù)區(qū)間的DNA序列，是近年來在微衛(wèi)星(SSR)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一類新型分子標(biāo)記技術(shù)[6-7]，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合了RAPD和AFLP二者的技術(shù)優(yōu)勢。ISSR-PCR技術(shù)的模板來自于植物基因組DNA中廣泛存在的微衛(wèi)星基因，通過該重復(fù)序列設(shè)計(jì)多態(tài)性引物，對(duì)與引物互補(bǔ)且反向的簡單重復(fù)序列間的小片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8-9]，并對(duì)擴(kuò)增得到的多個(gè)電泳條帶進(jìn)行記帶統(tǒng)計(jì)分析。為了能進(jìn)一步探索不同來源金蕎麥種質(zhì)資源遺傳多樣性，本研究采用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)來自11個(gè)縣(市)的金蕎麥種質(zhì)的遺傳多樣性水平進(jìn)行分析,以期為貴州野生金蕎麥的種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 金蕎麥

以11個(gè)不同地域來源的金蕎麥為供試材料，詳見表1。

表1 金蕎麥種質(zhì)材料來源

1.1.2 主要試劑

快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)試劑盒、TaqDNA 聚合酶、10×TaqBuffer、dNTP、MgCl2、DL 2 000 DNA Marker、100 bp Ladder、Hind Ⅲ Marker、Tris堿等主要試劑均購自生工生物工程有限公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取

從金蕎麥成熟葉片中提取DNA的方法是采用快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)試劑盒，對(duì)所提取的基因組DNA用0.8%瓊脂糖凝膠(含GLOD VIEW核酸染色劑)電泳檢測DNA質(zhì)量，用紫外分光光度計(jì)檢測DNA樣品的質(zhì)量和濃度，稀釋樣品濃度至20.0 ng/μL后分裝并貯于-20 ℃條件下備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系參照王湘瑩等[10]的研究體系：在20μL的反應(yīng)體系中10×PCR buffer(不含Mg2+) 2.0μL，2 UTaqDNA聚合酶0.1μL，0.25 mmol/L dNTPs 2.5μL，20 ng/μL基因組DNA 1.0μL，2.5 mmol/L Mg2+1.2μL，100μmol/L引物0.6μL，去離子水12.6μL。

反應(yīng)條件參照李娜等[11]的研究反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性30 s；每個(gè)引物的退火溫度延伸2 min(退火溫度見表2)，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓120 V，時(shí)間45 min，并以D 2000 DNA mark的分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)照。

1.2.3 引物篩選

本研究采用L18(35)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[12],從40個(gè)隨機(jī)引物中篩選出11個(gè)條帶豐富、穩(wěn)定性強(qiáng)的引物(見表2)，ISSR引物序列參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的引物。

表2 ISSR-PCR反應(yīng)體系引物堿基序列及退火溫度

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

ISSR多態(tài)性統(tǒng)計(jì):ISSR擴(kuò)增結(jié)果采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，每引物檢測結(jié)果重復(fù)3次，以條帶清晰可重復(fù)為選取原則，不同品種間按同一電泳位置ISSR條帶的有無進(jìn)行計(jì)數(shù)。同一電泳位置有帶記為“1”，無帶記為“0”，建立數(shù)據(jù)庫，并利用Popgen軟件進(jìn)行遺傳參數(shù)分析[13]。分別計(jì)算ISSR多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)，計(jì)算方法為：多態(tài)性百分率(%)=特征譜帶數(shù)/總譜帶數(shù)×100%。通過DPS 3.0軟件，根據(jù)相似性系數(shù)公式計(jì)算金蕎麥類群間DNA分子水平上的遺傳距離。相似性系數(shù)Sxy=2Nxy/Nx+Ny，則遺傳距離為GD=1-Sxy[14]。并根據(jù)遺傳距離，對(duì)類群建立UPGMA聚類分析。

表4 11個(gè)物種間的遺傳距離

注：M分子量標(biāo)準(zhǔn)D 2 000 DNA marker；1～22：PCR產(chǎn)物圖1 2個(gè)樣品篩選引物

圖2 11份金蕎麥品種的聚類圖

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及ISSR-PCR擴(kuò)增多態(tài)性分析

如圖1所示，利用ISSR-PCR方法從40條通用引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的P 5、P 6、P 8、P 11、P 20、P 23、P 24、P 27、P 29、P 30、P 33共11條引物。利用圖1中11條ISSR引物，以11種不同地域來源的金蕎麥DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行電泳檢測。結(jié)果表明，11條隨機(jī)引物共擴(kuò)增清晰可重復(fù)條帶103條，每條引物平均擴(kuò)增9.4條帶，擴(kuò)增片段大小在500～2 000 bp之間；同時(shí)不同地域的供試材料ISSR多態(tài)性因引物不同而有所變化，其中P 20擴(kuò)增效果較差(3～5條)，多態(tài)性相對(duì)較差，而P 5擴(kuò)增效果最好，共擴(kuò)增出12條帶紋，其中多態(tài)性帶紋10條(圖1)；在總體條帶中75個(gè)位點(diǎn)的DNA片段具有多態(tài)性，其多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPB)為72.8%，表明貴州省金蕎麥品種群體間遺傳多樣性水平較高。

2.2 遺傳距離分析

由表4可看出，通過Nei-Li相似系數(shù)法對(duì)貴州省11份不同來源的金蕎麥品種間遺傳相似系數(shù)(GS)進(jìn)行了估算，GS值在0.48～0.90之間，表明遺傳多樣性較豐富；11種金蕎麥品種間遺傳距離GD在0.10～0.52之間，平均為0.27，品種間的遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，種間遺傳差異較小，種間遺傳分化程度較低。

2.3 聚類分析

如圖2所示，利用遺傳相似系數(shù)對(duì)11份金蕎麥材料進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，所有品種被分為2大類：貴陽、納雍、內(nèi)江、大方、水城、畢節(jié)聚在一類中，羅甸、獨(dú)山、開陽、平壩、息烽聚在一類。在第一類中，大方和水城最先聚在一起，說明二者親緣關(guān)系較近，而貴陽與另外5個(gè)地區(qū)金蕎麥親緣關(guān)系較遠(yuǎn)則單獨(dú)聚類；第二大類中，羅甸和獨(dú)山兩個(gè)地域金蕎麥最先聚為一類，且遺傳距離短，說明二者親緣關(guān)系近，這種系統(tǒng)樹反映了物種間的親緣關(guān)系和品種間遺傳變異的實(shí)質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

ISSR標(biāo)記技術(shù)檢測到的是簡單序列重復(fù)區(qū)間的一個(gè)單一的DNA片段，并對(duì)2個(gè)SSR之間的一段短的基因片段的多態(tài)性進(jìn)行分析研究，ISSR標(biāo)記符合孟德爾遺傳規(guī)律[15]。ISSR標(biāo)記在種質(zhì)資源鑒定、遺傳作圖、基因定位、系統(tǒng)與進(jìn)化等方面得到了普遍的應(yīng)用。

本研究基于ISSR標(biāo)記分析得出了11份金蕎麥品種間的親緣關(guān)系，品種間的遺傳基礎(chǔ)相對(duì)穩(wěn)定，種間遺傳差異較小，這可能是由于本研究選用的金蕎麥都屬于當(dāng)?shù)匾吧N質(zhì)資源，未經(jīng)過特異的馴化和變異。但是部分結(jié)果與系譜不一致，這可以推定，同一自交系長期在不同地域地質(zhì)條件、氣候條件影響下繁殖和被利用，產(chǎn)生了基因漂移或突變。種質(zhì)間有分類，與其特異的遺傳基礎(chǔ)存在差別有關(guān)。部分品種有相對(duì)聚合現(xiàn)象，與其親緣關(guān)系較近有關(guān)。不同地域品種間能聚在一類，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是由于在進(jìn)化過程中，它們面臨的進(jìn)化環(huán)境和基因組DNA中部分序列進(jìn)化漂移或變異速度十分相似；而個(gè)別品種在進(jìn)化過程中自成一類，與其特有的進(jìn)化環(huán)境和遺傳基礎(chǔ)差異有較大關(guān)系。本研究對(duì)貴州省11個(gè)地區(qū)的金蕎麥種質(zhì)間遺傳多樣性及種間遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析比較,在后期研究中，可以為金蕎麥優(yōu)良牧草雜交親本選配、物種的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系等方面提供幫助,同時(shí)為金蕎麥品種ISSR指紋圖譜建立、種質(zhì)資源鑒定、基因定位等工作提供科學(xué)依據(jù)。

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