二氧化鋯對大鼠牙周膜細(xì)胞分子生物學(xué)行為的影響*

黃玉喜 王莉莉 張振庭 李京榮 劉洪良 董海濤

全瓷冠如今已經(jīng)逐漸發(fā)展成為了口腔固定修復(fù)的主要修復(fù)材料。在各類全瓷冠體系中，二氧化鋯全瓷冠的機(jī)械性能、美學(xué)性能均得到臨床的廣泛認(rèn)可。相對于金屬烤瓷冠，特別是鎳鉻合金烤瓷冠、鈷鉻合金烤瓷冠的細(xì)胞毒性而言，全瓷冠的不良反應(yīng)較少[1-3]。對于口腔修復(fù)材料的生物安全性，諸多學(xué)者都做了相關(guān)的研究，發(fā)現(xiàn)金屬烤瓷冠中的金屬成分對機(jī)體均存在某種形式的影響，無論何種金屬均如此，即使在全瓷冠中，金屬的含量也存在，但低于10%[4，5]。二氧化鋯屬于惰性陶瓷，不會引起細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，無細(xì)胞毒性、無誘變、致畸、致癌等作用，已有實(shí)驗(yàn)對二氧化鋯全瓷冠的細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)行了評價(jià)，認(rèn)為其生物相容性良好且安全性較高[6]。但有研究者發(fā)現(xiàn)在37℃的人工唾液中檢測到有鋯離子、釔離子的釋放，甚至在酸性條件下，金屬離子成分釋放的更多[7]。此外，在二氧化鋯的加工制作過程中也難免會有雜質(zhì)的滲入。因此，對于二氧化鋯的生物安全性有必要進(jìn)行進(jìn)一步的檢測。目前，主要的研究多集中在二氧化鋯全瓷冠的細(xì)胞生物相容性、細(xì)胞生物學(xué)行為方面，但二氧化鋯與牙周膜細(xì)胞之間相互作用的分子生物學(xué)行為的機(jī)制研究并不多。本文將二氧化鋯制作的浸提液作用于大鼠的牙周膜細(xì)胞，對其細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、相關(guān)基因的表達(dá)影響如何等進(jìn)行了評價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.材料和方法

1.1 主要試劑及材料 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；胰蛋白酶(Hyclone，美國)；PBS(Amresco，美國)；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板(6孔、24孔、96孔)(Corning公司，美國)；CO2孵箱(Shellab,美國)；ZHJH-C1118C型超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；CKX41型倒置相差顯微鏡；DT5-1低速離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；5y2002型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，美國)；真空鑄造機(jī)(ARGONCASTER-SE，Shofu，Japan)；鎳鉻合金、鈀銀合金的相關(guān)材料(vita，美國)；二氧化鋯瓷塊(WIELAND公司，德國)；低速精密切割機(jī)(Isomet 4000，Buehler，美國)；酶聯(lián)免疫儀(Bio-Rad公司，美國)；CCK-8試劑盒(Cell ProliferationAaaay,Promega公司，美國)；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(BU-Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit,Biouniquer公司，美國)；PCR擴(kuò)增儀(2720，Applied biosystems，USA)； Real-time qPCR 儀 (7500Fast， Applied biosystems，USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠牙周膜細(xì)胞的培養(yǎng)及胚胎來源的鑒定 將SD大鼠的上下頜頜骨分離，取出其上下磨牙，漂洗10次。刮取磨牙根中1/3的牙周膜組織，剪碎，采用胰酶消化法，將牙周膜碎屑平鋪于培養(yǎng)皿中置于CO2孵箱內(nèi)(37℃，5%CO2，100%濕度)。當(dāng)牙周膜細(xì)胞生長覆蓋達(dá)到培養(yǎng)皿底約60%時(shí)，進(jìn)行首次傳代。對細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞回縮至圓形時(shí)，棄去胰酶，加入含l5%FBS的DMEM，反復(fù)吹打，制成細(xì)胞懸液，將此細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞再次長滿瓶底時(shí)，對細(xì)胞進(jìn)行傳代。第4代細(xì)胞用于細(xì)胞來源鑒定及后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及各組試件的制作 實(shí)驗(yàn)組(二氧化鋯試件組)；陽性對照組1(鎳鉻合金試件組)；陽性對照組2(鈀銀合金試件組)；陰性對照組(DMEM培養(yǎng)液組)。

于技工室按照烤瓷熔附金屬修復(fù)體的制作要求在真空加氬氣保護(hù)環(huán)境下對陽性對照組的合金材料進(jìn)行熔鑄，獲得1cm×1cm×3mm的陽性對照組試件。利用低速精密切割機(jī)將二氧化鋯瓷塊在噴水冷卻條件下切割成1cm×1cm×3mm的實(shí)驗(yàn)組試件。將所得的所有合金試件經(jīng)碳化硅砂紙(P240-P1200)由粗到細(xì)進(jìn)行拋光，后置于95%的乙醇溶液中超聲清洗20min，再去離子水漂洗10min，無油無水壓縮空氣吹干，經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌后備用。

1.2.3 各組材料浸提液的制備 按照試件表面積與細(xì)胞培養(yǎng)液之比為0.5cm2/ml的標(biāo)準(zhǔn)，在6孔板中每孔加入6.4ml的DMEM培養(yǎng)液，置于CO2孵箱內(nèi)(37℃、5%CO2、100%濕度的條件下)，浸提96h后備用。

1.2.4 細(xì)胞活性檢測——Cell Counting Kit-8取第四代大鼠牙周膜細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104/ml，接種于96孔板中，每孔100μL。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，按各自的分組，將不同組的浸提液加入每孔中，每孔浸提液100μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將其置入CO2孵箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)24h、48h、72h。終止實(shí)驗(yàn)時(shí)，將孔板內(nèi)注入10μL CCK-8溶液，孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2h后，30min內(nèi)在酶標(biāo)儀上讀取吸光光度值OD490nm。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值均數(shù)/對照組吸光度值均數(shù))×100%。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測——Annexin V/PI雙染色法 取第四代大鼠牙周膜細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/ml，接種于96孔板中，每孔100μL。待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，按各自的分組，將不同組的浸提液加入每孔中，每孔浸提液100μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將其置入CO2孵箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml，以PBS離心2000rpm，5min，洗滌2次，收到約5×105個(gè)細(xì)胞。將處理所得細(xì)胞取出一部分，加入500μL的Annexin V Bingding Buffer懸浮細(xì)胞，再加入5μL的Annexin V-FITC混勻后，加入5μL Propidiumlodide混勻、避光下，染色30min，在流式細(xì)胞儀以激發(fā)波長488nm、發(fā)射波長530nm檢測細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率。將處理所得的另一部分細(xì)胞70%冰乙醇固定后加入PI在室溫下進(jìn)行避光染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的不同細(xì)胞周期的比例。

1.2.6 凋亡相關(guān)分子表達(dá)量的檢測 取第四代大鼠的牙周膜細(xì)胞，按傳代的方法將其制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×105個(gè)/ml，接種于六孔板中，待細(xì)胞長滿約孔板底的80%左右時(shí)，以不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置換，血清饑餓24h，使細(xì)胞周期同步化。陰性對照組以新鮮培養(yǎng)液置換，其余各組分別用各組試件的浸提液置換并標(biāo)記，置于CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48h。抽提RNA，依照相應(yīng)試劑盒進(jìn)行操作，反應(yīng)得到cDNA，而后進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，擴(kuò)增的基因包括Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9，根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量(2-ΔΔCT值)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 各組材料浸提液對大鼠牙周膜細(xì)胞形態(tài)的影響 大鼠牙周膜細(xì)胞在各組浸提液中培養(yǎng)48h后，DMEM培養(yǎng)液組中為正常牙周膜細(xì)胞形態(tài)，呈長梭形或多角星形；二氧化鋯組的細(xì)胞形態(tài)亦呈梭形或多角形，貼壁生長且輪廓清晰，核漿比例正常，胞質(zhì)均勻；鈀銀合金組的細(xì)胞生長狀態(tài)亦良好，偶見脫落的懸浮細(xì)胞；鎳鉻合金組的細(xì)胞部分貼壁生長，有部分細(xì)胞呈圓形或不規(guī)則形態(tài)，胞膜增厚，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，還可見一些質(zhì)膜崩解、核膜破裂的死亡細(xì)胞(見圖1)。

圖1 不同材料浸提液對大鼠牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)48h的形態(tài)觀察

2.2不同時(shí)間點(diǎn)的各組材料浸提液對大鼠牙周膜細(xì)胞活性的影響 應(yīng)用CCK-8法檢測不同時(shí)間點(diǎn)的各組材料浸提液對大鼠牙周膜細(xì)胞活性的影響，由表1可以看出，24h時(shí)二氧化鋯組、鈀銀合金組抑制率分別為1.40%和2.75%，與DMEM陰性對照組三者之間兩兩比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而鎳鉻合金組抑制率13.41%明顯高于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。48h時(shí)，DMEM組、二氧化鋯組、鈀銀合金組的OD值都略有增長，與DMEM陰性對照組三者之間兩兩比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但鎳鉻合金組OD值增長緩慢，高于其余各組，與其余各組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。隨著時(shí)間的增長，當(dāng)72h時(shí)，二氧化鋯組、鈀銀合金組的OD值依舊在增長，與DMEM陰性對照組三者之間兩兩比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，鎳鉻合金組OD值基本無增長，而抑制率已經(jīng)達(dá)到了22.42%，明顯高于其余各組(P＜0.05)。

表1 CCK-8法檢測不同時(shí)間點(diǎn)的各組材料浸提液對大鼠牙周膜細(xì)胞活性的影響(n=5，xˉ±SD，%)

2.3 各組材料浸提液對大鼠牙周膜細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測了各組材料浸提液對大鼠牙周膜細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組材料浸提液作用于大鼠牙周膜細(xì)胞48h后，早期細(xì)胞凋亡率二氧化鋯組最低，為0.51%，鈀銀合金組次之，鎳鉻合金組最高，達(dá)到17.72%，二氧化鋯組、鈀銀合金組、鎳鉻合金組三者間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。晚期細(xì)胞凋亡率、總凋亡率也如此，二氧化鋯組、鈀銀合金組與鎳鉻合金組兩兩比較均有差異(P＜0.05)(見表2，圖2)。

表2 各組材料浸提液對大鼠牙周膜細(xì)胞凋亡率的影響(n=5,%)

圖2 各組材料浸提液對大鼠牙周膜細(xì)胞凋亡率的檢測

2.4 各組材料浸提液對大鼠牙周膜細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 各組材料浸提液作用于大鼠牙周膜細(xì)胞48h后，DMEM組的G0/G1期細(xì)胞周期比例最低，Prl指數(shù)最高。二氧化鋯組與DMEM組的G0/G1期細(xì)胞周期比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，鈀銀合金組、鎳鉻合金組的G0/G1期均高于前兩組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，鈀銀合金組與鎳鉻合金組之間的G0/G1期無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。Prl指數(shù)從高到低依次為二氧化鋯組、鈀銀合金組、鎳鉻合金組，鈀銀合金組、鎳鉻合金組與二氧化鋯組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，鈀銀合金組與鎳鉻合金組之間的Prl指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表3。

2.5 不同浸提液組處理對大鼠牙周膜細(xì)胞Caspase含量的影響 各組Caspase-3的 2-ΔΔCT值從數(shù)值上看由大到小依次為：鎳鉻合金組＞DMEM組＞鈀銀合金組＞二氧化鋯組，二氧化鋯組、鈀銀合金組mRNA的相對表達(dá)量低于DMEM組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，鎳鉻合金組mRNA的相對表達(dá)量高于DMEM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組 Caspase-8 的 2-ΔΔCT值從數(shù)值上看由大到小依次為：DMEM組＞鎳鉻合金組＞二氧化鋯組＞鈀銀合金組，二氧化鋯組、鈀銀合金組、鎳鉻合金組的mRNA相對表達(dá)量均低于DMEM組，但二氧化鋯組、鈀銀合金組與DMEM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，二氧化鋯組與鈀銀合金組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，鎳鉻合金組高于二氧化鋯組、鈀銀合金組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組 Caspase-9 的 2-ΔΔCT值從數(shù)值上看由大到小依次為：鎳鉻合金組＞DMEM組＞二氧化鋯組＞鈀銀合金組，二氧化鋯組、鈀銀合金組mRNA的相對表達(dá)量低于DMEM組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，鎳鉻合金組mRNA的相對表達(dá)量高于DMEM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。具體見表4。

表3 各組材料浸提液對大鼠牙周膜細(xì)胞細(xì)胞周期的影響(n=5,%)

表4 不同浸提液組處理對大鼠牙周膜細(xì)胞CaspasemRNA相對表達(dá)量(2-ΔΔCT 值)的比較(xˉ±SD， n=5)

3.討論

全瓷冠與金屬烤瓷冠在用于臨床牙冠修復(fù)時(shí)，不僅要考慮修復(fù)材料的耐磨性及強(qiáng)度外，還應(yīng)考慮材料的生物相容性。金屬烤瓷冠的物理強(qiáng)度是可以滿足臨床冠修復(fù)的要求，但是對于牙齦的刺激性不容忽視。全瓷冠的組織相容性及耐腐蝕性均較理想，即使在齦溝液的持續(xù)作用下也基本不會有金屬離子的析出，因此對牙周組織的損傷較小[8]。對于二氧化鋯的研究，國內(nèi)外多集中在它的細(xì)胞生物相容性、細(xì)胞生物學(xué)行為方面，例如細(xì)胞增殖率、毒性的分級、溶血能力等[9,10]，但對于其為何會產(chǎn)生如此結(jié)果的分子生物學(xué)行為，研究甚少。本研究從分子生物學(xué)行為入手，研究分析了二氧化鋯全瓷冠、鈀銀合金烤瓷冠、鎳鉻合金烤瓷冠浸提液對大鼠牙周膜細(xì)胞的活性、細(xì)胞周期、凋亡及相關(guān)mRNA的表達(dá)的影響。

近年來，越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，牙周膜成纖維細(xì)胞的功能異常與牙周炎的發(fā)生、牙槽骨的吸收有密切的聯(lián)系，不同材料制作出的浸提液作用于牙周膜細(xì)胞，其損傷程度基本能反映出不同修復(fù)材料對牙周組織的損傷程度[11]。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)了大鼠的牙周膜細(xì)胞，經(jīng)二氧化鋯全瓷冠、鈀銀合金烤瓷冠、鎳鉻合金浸提液處理后，以CCK-8法檢測細(xì)胞的活性。經(jīng)活力分析可知，二氧化鋯組、鈀銀合金組、DMEM組OD值兩兩比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而鎳鉻合金組OD值明顯高于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明二氧化鋯全瓷冠、鈀銀合金烤瓷冠不會造成牙周膜細(xì)胞的損傷。流式細(xì)胞術(shù)是通過對DNA含量的計(jì)算來推算出細(xì)胞所處的細(xì)胞周期。所以，流式細(xì)胞術(shù)只能將G0/G1、S期、G2期的細(xì)胞區(qū)分開。細(xì)胞的Pr I指數(shù)為G2/M與S期占細(xì)胞總量的比例，它能夠反映細(xì)胞對DNA的復(fù)制能力。在流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期的檢測中也發(fā)現(xiàn)，能夠反映細(xì)胞增殖活力的Pr I指數(shù)，二氧化鋯的表現(xiàn)優(yōu)于鈀銀合金及鎳鉻合金，這也從另一方面說明了二氧化鋯對細(xì)胞周期沒有抑制作用。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)極復(fù)雜，且受控于多種基因的死亡過程，它大體可以分為三個(gè)階段：起始階段、效應(yīng)階段、清除階段。它是一系列導(dǎo)致細(xì)胞解體的分子級聯(lián)反應(yīng)，它需要凋亡受體的激活，凋亡誘導(dǎo)因子的活化，轉(zhuǎn)導(dǎo)后引起線粒體的變化，隨著核酸內(nèi)切酶被激活，細(xì)胞即出現(xiàn)凋亡特有的表現(xiàn)，直至形成凋亡小體[12]。有學(xué)者提出，觀察細(xì)胞總RNA量結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)可以作為綜合評價(jià)材料生物相容性的參考[13]。有學(xué)者應(yīng)用RT-PCT方法來研究材料與細(xì)胞的交互過程，發(fā)現(xiàn)監(jiān)測細(xì)胞的mRNA表達(dá)量可以作為反映細(xì)胞與材料間生物相容性的有效手段之一[14]。天冬氨酸特異性半胱胺酸蛋白酶(Caspases)家族是線粒體凋亡通路下游重要的執(zhí)行分子。Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9均屬于Caspases家族。Caspases-8、Caspases-9作為啟動者，當(dāng)?shù)玫叫盘枙r(shí)，可通過自剪接激活，從而引發(fā)Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，此時(shí)細(xì)胞凋亡開始；Caspases-3作為執(zhí)行者，可使細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白、功能蛋白發(fā)揮作用，引起凋亡，但它不參與自剪接，這提示我們，可能仍存在其他的凋亡因子或凋亡途徑參與了細(xì)胞的凋亡反應(yīng)[15]。本文對二氧化鋯、鈀銀合金、鎳鉻合金浸提液處理后的細(xì)胞Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9 mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)Caspase-3、Caspase-9 的 2-ΔΔCT值，二氧化鋯組、鈀銀合金組與DMEM組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，鎳鉻合金組高于DMEM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組 Caspase-8 的 2-ΔΔCT值，二氧化鋯組、鈀銀合金組與DMEM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，二氧化鋯組與鈀銀合金組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，鎳鉻合金組高于二氧化鋯組、鈀銀合金組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，二氧化鋯、鈀銀合金的 Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9 mRNA相對表達(dá)量并未增多，這與李菊等研究結(jié)果相似，二氧化鋯不會增加 Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9 mRNA相對表達(dá)量[16]；而鎳鉻合金的 Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9mRNA相對表達(dá)量較高，這與林泓磊、王學(xué)等[17，18]利用流式細(xì)胞儀得出的鎳鉻合金會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的結(jié)果相一致。由此，本研究認(rèn)為，鎳鉻合金誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡可能是由內(nèi)源性途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號，從而引發(fā)了細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，二氧化鋯在提高細(xì)胞增殖活力，抑制細(xì)胞凋亡方面優(yōu)于鈀銀合金及鎳鉻合金材料，其良好的生物相容性，不會影響牙周膜細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及相關(guān)基因的表達(dá)。但本實(shí)驗(yàn)只對內(nèi)源性的少數(shù)幾個(gè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)進(jìn)行了研究，信號通路的傳導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜的過程，是否存在其它的凋亡因子或凋亡途徑仍需進(jìn)一步的研究。

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