還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶在脂多糖誘導的小鼠急性心肌損傷組織中的表達及意義

段明霞，唐其柱

(武漢大學人民醫(yī)院心內(nèi)科，武漢大學心血管病研究所，心血管病湖北省重點實驗室， 武漢 430060)

內(nèi)毒素血癥是由革蘭氏陰性菌釋放大量內(nèi)毒素而引起的一種全身炎癥反應，可發(fā)展為中毒性休克和多器官功能衰竭等。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是內(nèi)毒素的主要成分，屬于革蘭氏陰性菌外膜成分,具有劑量依賴性細胞毒作用，可引起嚴重的急性心肌損傷和心力衰竭。研究表明，LPS誘導心臟損傷而引起的病死率可達50%～60%，是重癥監(jiān)護室患者的首要死因[1,2]。因此，尋找和阻斷內(nèi)毒素血癥發(fā)生時心肌損傷的靶點，對診治和改善患者預后具有重要的臨床意義。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶的非吞噬細胞氧化酶(non-phagocytic cell oxidase,Nox) 家族是一類廣泛分布的跨膜蛋白，最先發(fā)現(xiàn)于中性粒細胞和巨噬細胞，是體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的主要來源之一[3]。研究表明，Nox依賴的ROS參與調(diào)節(jié)多種心血管疾病，如缺血性心肌病、心力衰竭、高血壓和心肌炎等[4，5]。Shah等[6]通過研究證實，心臟特異性高表達Nox 4可加重血管緊張素Ⅱ誘導的心肌重構(gòu)，而Nox 4抑制劑可顯著改善心功能，提示Nox在調(diào)控心肌重構(gòu)的過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，LPS可誘導心肌組織凋亡和心肌組織氧化損傷，表現(xiàn)為B細胞淋巴瘤/白血病蛋白-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)水平降低，Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、半胱氨酸天門冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteine aspastic acid-specific protease 3, Caspase 3)、4羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)水平升高[7]。Bax為促凋亡因子，在細胞中發(fā)揮促凋亡作用[8]。Caspase 3是凋亡途徑的下游效應部分，活化后的Caspase 3 (cleaved Caspase 3, c-Caspase 3)通過其酶解切割作用影響DNA的復制和轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮促凋亡作用[9]。4-HNE是ROS與生物大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應而形成的脂質(zhì)過氧化物，可反映心肌組織是否氧化損傷[10]。然而，Nox在LPS誘導的急性心肌損傷組織中的具體機制尚不明確。本研究探討了Nox在LPS誘導的急性心肌損傷組織中的表達及意義，以期為臨床治療內(nèi)毒素血癥所致的心肌損傷提供理論依據(jù)和干預靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

LPS購買于美國Sigma公司，純度>95%?？筃ox 2、Nox 4、Bax、Bcl-2、c-Caspase 3和4-HNE的一抗購買于英國Abcam公司，3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)購買于美國Santa cruz公司；免疫印跡熒光標記羊抗兔二抗IRdye@800 CWIgG 購買于LI-COR公司，免疫組織化學辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購買于艾吉泰康公司。 TRIZOL和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自瑞士Roche公司。主要的實驗儀器有超聲裂解儀、研磨儀、超高速離心機、分光光度計、酶標儀、水浴鍋、蛋白/核酸電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽、搖床、封膜機、脫水機、包埋機、病理切片機、組織攤片機、烤箱、倒置顯微鏡、雙色紅外熒光成像系統(tǒng)、實時熒光定量PCR檢測儀。

1.2 實驗動物和內(nèi)毒素血癥模型構(gòu)建

所有針對動物的操作都經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院動物倫理委員會批準。本實驗采用8～10周齡無特定病原體C57/BL6J雄性小鼠(n=30)，購于北京華富康生物科技有限公司。實驗動物購回后，適應實驗環(huán)境至少1周，隨后被隨機分為對照組和LPS組，每組15只。其中，LPS組一次性注射10 mg/kg的LPS，對照組注射等量生理鹽水。兩組小鼠均于注射后第6 h處死，取出小鼠心臟置于10%氯化鉀液，稱重后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；擬組織學方法檢測的心肌標本置于4%多聚甲醛中固定，脫水后石蠟包埋待切片。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應檢測基因表達

取約20 mg心肌組織加入EP管中并加入1 ml TRIZOL，研磨后加入200 μl三氯甲烷，12 000轉(zhuǎn)/min離心15 min后吸取上清液，加入等體積異丙醇，12 000轉(zhuǎn)/min離心15 min后,將沉淀的核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)溶于焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水中,分光光度計測定RNA濃度。當A260/A280比值在1.8～2.0，A230/A260比值>2.0即表明可用，計算RNA提取量。

通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，GAPDH作為內(nèi)參照，羅氏LightCycler480 Real-time PCR儀進行擴增并對PCR結(jié)果進行定量分析。擴增條件： 95℃預變性10 min；95℃變性15 s、60℃ 退火8 s、72℃延伸25 s，共40個循環(huán)。目的基因以GAPDH為內(nèi)參照對其表達量進行校正。利用Primer-BLAST在線設計引物序列，由上海生物工程有限公司合成(表1)。

1.4 Western blotting

從-80℃冰箱取出心臟標本，取30～40 mg心肌組織放入離心管中，加入裂解液，放入研磨儀中研磨，研磨完全后再使用超聲裂解儀裂解標本，使細胞蛋白充分釋放。采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid disodium,BCA)法測定蛋白濃度，加入相應上樣緩沖液和水，使蛋白樣本濃度均一化，72℃水浴10 min使蛋白變性。取適量蛋白樣本放入10%基質(zhì)鈉十二烷基硫酸聚丙烯胺凝膠電泳(substrate-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)膠進行電泳分離，90 V恒壓電泳2 h。電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)膜儀將目的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上，清洗3次后使用5%脫脂牛奶封閉1.5 h。封閉完成后4℃孵育一抗過夜。TBST緩沖液清洗膜3遍后，加入IRdye@800 CW標記的羊抗兔IgG 二抗37℃孵育1 h，清洗3遍后使用雙色紅外成像系統(tǒng)進行掃膜分析。以GAPDH為內(nèi)參照分析和計算Nox 2、Nox 4、Bax、Bcl-2和Caspase 3蛋白表達水平。

表1 Nox 2、Nox 4、Bax和Bcl-2基因引物序列

Nox: non-phagocytic cell oxidase; Bax: Bcl-2-associated X protein; Bcl-2: B cell lymphoma/leukemia-2; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

1.5 免疫組織化學方法

60℃烤片30 min，二甲苯3次脫蠟,每次5 min，無水乙醇、95%乙醇和70%乙醇各3遍脫水。采用3%甲醇雙氧水來抑制內(nèi)生過氧化物酶的活性，并用8%羊血清封閉60 min，排除非特異性抗原?？?-HNE的一抗使用1∶100磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)稀釋，4℃過夜。隨后用PBS清洗5遍，加入辣根過氧化物酶標記二抗,繼續(xù)清洗，隨后加入二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)。每組隨機選取10個樣本，每個樣本隨機選取1個視野，采用Image-Pro Plus 6.0(IPP)軟件計算4-HNE分布面積取平均值。對照組心臟組織呈灰白色，無4-HNE分泌，LPS組心臟組織可見著色的4-HNE。

1.6 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡

60℃烤片30 min，二甲苯脫蠟2次，每次5 min，梯度乙醇脫水；蛋白酶K工作液37℃處理組織玻片20 min后，PBS漂洗2次，每次5 min；LPS組玻片加50 μl末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxyribonucleotidyl transferase,TdT)+450 μl熒光素標記的脫氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate，dUTP)液；對照組僅加50 μl熒光素標記的dUTP液；玻片干后加50 μl TdT介導的dUTP切口末端標記技術(shù)(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)反應混合液于標本上，加蓋玻片在37℃中反應1 h；PBS漂洗3次，每次5 min；玻片干后加50 μl 辣根過氧化物酶標記的熒光抗體于標本上，于37℃中反應30 min；PBS漂洗3次，每次5 min；隨后滴加100 μl DAB底物，室溫反應10 min；PBS漂洗3次，每次5 min；觀察后用蘇木素復染3 s，流水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯使切片透明，中性樹膠封片，然后200倍鏡頭下拍照。每組隨機選取10個樣本，每個樣本隨機選取1個視野，采用Image-Pro Plus 6.0(IPP)軟件計算心肌凋亡細胞數(shù)取平均值。正常心肌細胞核呈藍色，凋亡細胞胞核呈致密濃染。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組心肌組織Nox 2、Nox 4、Bax和Bcl-2基因表達水平比較

相比對照組，LPS組小鼠心肌Nox2、Nox4、Bax基因表達水平明顯升高，Bcl-2基因表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖1)。

圖1 Nox 2、Nox 4、Bax、Bcl-2基因在對照組和LPS組中的表達Figure 1 Expression of Nox 2, Nox 4, Bax and Bcl-2gene between control and LPS groupNox: non-phagocytic cell oxidase; Bax: Bcl-2-associated X protein;Bcl-2： B cell lymphoma/leukemia-2; LPS: lipopolysaccharides.Compared with control group, *P<0.05

2.2 兩組心肌組織Nox 2、Nox 4、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較

相比對照組，LPS組心肌組織Nox 2、Nox 4、 Bax蛋白表達水平明顯增加,Bcl-2蛋白表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05;圖2)。

圖2 Nox 2、Nox 4、Bax、Bcl-2和caspase 3蛋白在對照組和LPS組中的表達Figure 2 Expression of Nox 2, Nox 4, Bax and Caspase 3protein in control and LPS groups

A: Western blotting results; B: quantitative analysis results. Nox: non-phagocytic cell oxidase; Bax: Bcl-2-associated X protein; Bcl-2: B cell lymphoma/leukemia-2; LPS: lipopolysaccharides. Compared with control group,*P<0.05

2.3 免疫組織化學結(jié)果比較

相比對照組，LPS組心肌組織4-HNE表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖3)。

2.5 TUNEL結(jié)果比較

相比對照組，LPS組心肌組織心肌凋亡細胞明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖4)。

3 討 論

LPS由類脂A、核心多糖和O-特異性多糖側(cè)鏈等組成，其中類脂A是LPS最主要的生物活性成分。研究表明，少量LPS刺激機體時，可通過誘導干擾素產(chǎn)生而增強機體的固有免疫功能，而大量LPS釋放入血，可激活單核-巨噬細胞，誘發(fā)全身炎癥反應綜合征，嚴重時可引起彌漫性血管內(nèi)凝血和多器官功能衰竭[11]。大量研究證實，多種因素參與內(nèi)毒素血癥誘導的心功能障礙，包括氧化應激、炎癥、心肌能量代謝和微血管功能障礙等。其中，氧化應激被認為是誘導心功能障礙的主要原因[12]。已有臨床研究表明，內(nèi)毒素血癥患者氧化應激水平與預后密切相關(guān)，且氧化應激水平越高，預后越差[13]。內(nèi)毒素血癥發(fā)生時,機體內(nèi)超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等ROS成分大量蓄積，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和功能，進而引起細胞凋亡，導致組織損傷和器官功能障礙。據(jù)研究，ROS和其產(chǎn)生的氧化應激在細胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，大量ROS可通過啟動凋亡信號來促進心肌細胞凋亡?？寡趸瘎┤鏝-乙酰半胱氨酸可抑制或延遲細胞凋亡[14]。4-HNE是一種脂質(zhì)過氧化物，通過與線粒體蛋白形成加合物對心肌發(fā)揮破壞性影響[15]。本研究結(jié)果表明一次性注射大劑量LPS誘導的急性心肌組織損傷模型中，心肌組織氧化損傷標志物4-HNE表達增加，表明LPS可加重心肌組織脂質(zhì)過氧化，導致氧化應激損傷。

循環(huán)系統(tǒng)主要表達4種Nox亞型，而心肌細胞主要表達Nox 2和Nox 4。Nox 2主要位于內(nèi)皮細胞、心肌細胞和成纖維細胞中，生理條件下，Nox 2處于未激活狀態(tài)，不具有生物功能。 炎癥、 中毒等刺激可激活Nox 2，通過NADPH將氧分子轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x氧。研究表明，Nox2基因在人心肌梗死區(qū)域表達增加，而敲除Nox2基因可明顯改善心肌梗死小鼠的左心室功能[16，17]。而Nox 4主要通過其和游離氧的歧化作用產(chǎn)生過氧化氫，從而調(diào)節(jié)ROS的生成[18]。Matsushima等[19]發(fā)現(xiàn)特異性敲除心臟Nox4基因可減輕壓力超負荷誘導的線粒體和心功能障礙。此外，Sun等[20]通過研究發(fā)現(xiàn)高級氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidative protein products，AOPPs)可誘導細胞凋亡，Nox 4、Bax蛋白表達增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降。上述研究提示Nox依賴ROS的產(chǎn)生可促進心肌細胞凋亡。本研究表明相比對照組，LPS組心肌組織促凋亡因子Nox2、Nox4、Bax基因和蛋白表達增加,抗凋亡因子Bcl-2基因和蛋白表達降低，TUNEL染色結(jié)果提示LPS組小鼠心肌組織凋亡細胞數(shù)增加，我們推測Nox依賴ROS的增加，激活相關(guān)通路，從而引起心肌細胞凋亡，而干預Nox通路有可能是治療內(nèi)毒素血癥患者的有效靶點。

圖3 免疫組織化學法檢測兩組心肌組織4-HNE表達Figure 3 Detection of 4-HNE expression in myocardium by immunohistochemistry (PAP ×200)HNE: 4-hydroxynonenal. A: control group; B: LPS group; C: quantitative analysis results. Compared with control group, *P<0.05

圖4 TUNEL法檢測心肌組織凋亡細胞Figure 4 Detection of myocardial apoptotic cells by TUNEL ( ×200)TUNEL: TdT-mediated dUTP nick-end labeling. A: control group; B: LPS group;C: quantitative results. Compared with control group, *P<0.05

本研究也存在一定的局限性：Nox是否直接通過氧化應激來發(fā)揮作用尚需進一步探討；Nox是否通過其他途徑影響LPS誘導的心肌細胞凋亡尚不清楚；Nox通過何種具體機制影響LPS誘導的急性心肌損傷也需后期研究探討。

[1] Zhang J, Zhao P, Quan N,etal. The endotoxemia cardiac dysfunction is attenuated by AMPK/mTOR signaling pathway regulating autophagy[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017, 492(3): 520-527. DOI: 10.1016/j.bbrc.2017.08.034.

[2] Rhodes A, Evans LE, Alhazzani W,etal. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock: 2016[J]. Crit Care Med, 2017, 45(3): 486-552. DOI: 10.1097/CCM.0000000000002255.

[3] Spencer N, Engelhardt JF. The basic biology of redoxosomes in cytokine-mediated signal transduction and implications for disease-specific therapies[J]. Biochemistry, 2014, 53(10): 1551-1564. DOI: 10.1021/bi401719r.

[4] Zhang M, Perino A, Ghigo A,etal. NADPH oxidases in heart failure: poachers or gamekeepers? [J]. Antioxid Redox Signal, 2013, 18(9): 1024-1041. DOI: 10.1089/ars.2012.4550.

[5] 池小鉅, 呂卓, 岑孌. NADPH氧化酶p22phox亞基基因多態(tài)性與高血壓左心室肥厚的相關(guān)性[J]. 中華老年多器官疾病雜志, 2013, 12(6): 438-441. DOI:10.3724/SP.J.1264.2013.00109.

Chi XJ, Lyu Z, Cen L. Correlation of p22phox gene polymorphism of NADPH oxidase with left ventricular hypertrophy in hypertensive patients[J].Chin J Mult Organ Dis Elderly, 2013, 12(6): 438-441. DOI: 10.3724/SP.J.1264.2013.00109.

[6] Shah AM. Parsing the role of NADPH oxidase enzymes and reactive oxygen species in heart failure[J]. Circulation, 2015, 131(7): 602-604. DOI: 10.1161/CIRC ULATIONA HA.115.014906.

[7] Um HD. Bcl-2 family proteins as regulators of cancer cell invasion and metastasis: a review focusing on mitochondrial respiration and reactive oxygen species[J]. Oncotarget, 2016, 7(5): 5193-5203. DOI: 10.18632/oncotarget.6405.

[8] Maes ME, Schlamp CL, Nickells RW. BAX to basics: how the BCL2 gene family controls the death of retinal ganglion cells[J]. Prog Retin Eye Res, 2017, 57: 1-25. DOI:10.1016/j.preteyeres. 2017.01.002.

[9] Odonkor CA, Achilefu S. Modulation of effector caspase cleavage determines response of breast and lung tumor cell lines to chemotherapy[J]. Cancer Invest, 2009, 27(4): 417-429.

[10] Zhang J, Zhu D, Wang Y,etal. Andrographolide attenuates LPS-induced cardiac malfunctions through inhibition of IκB phosphorylation and apoptosis in mice[J].Cell Physiol Biochem, 2015, 37(4): 1619-1628. DOI:10.1159/000438528.

[11] Anwar MA, Choi S. Gram-negative marine bacteria: structural features of lipopolysaccharides and their relevance for economically important diseases[J]. Mar Drugs, 2014, 12(5): 2485-2514. DOI: 10.3390/md12052485.

[12] Marchant DJ, Boyd JH, Lin DC,etal. Inflammation in myocardial diseases[J]. Circ Res, 2012, 110(1): 126-144. DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.111.243170.

[13] Paoli G, Valente S, Ardissino D,etal. Myocardial dysfunction during sepsis: epidemiology, prognosis and treatment[J]. G Ital Cardiol (Rome), 2011, 12(12): 804-814. DOI: 10.1714/996.10825.

[14] Sinha K, Das J, Pal PB,etal. Oxidative stress: the mitochondria-dependent and mitochondria-independent pathways of apoptosis[J]. Arch Toxicol, 2013, 87(7): 1157-1180. DOI: 10.1007/s00204-013-1034-4.

[15] Deshpande M, Mali VR, Pan G,etal. Increased 4-hydroxy-2-nonenal-induced proteasome dysfunction is correlated with cardiac damage in streptozotocin-injected rats with isoproterenol infusion[J]. Cell Biochem Funct, 2016, 34(5): 334-342. DOI:10.1002/cbf.3195.

[16] Yang J, Brown ME, Zhang H,etal. High-throughput screening identifies microRNAs that target Nox 2 and improve function after acute myocardial infarction[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2017, 312(5): H1002-H1012. DOI: 10.1152/ajpheart.00685.2016.

[17] Cangemi R, Calvieri C, Bucci T,etal. Is Nox 2 upregulation implicated in myocardial injury in patients with pneumonia? [J]. Antioxid Redox Signal, 2014, 20(18): 2949-2954. DOI:10.1089/ ars.2013.5766.

[18] Siu KL, Lotz C, Ping P,etal. Netrin-1 abrogates ischemia/reperfusion-induced cardiac mitochondrial dysfunctionvianitric oxide-dependent attenuation of Nox 4 activation and recoupling of Nos[J]. J Mol Cell Cardiol, 2015, 78: 174-185. DOI: 10.1016/j.yjmcc.2014.07.005.

[19] Matsushima S, Kuroda J, Ago T,etal. Increased oxidative stress in the nucleus caused by Nox 4 mediates oxidation of HDAC4 and cardiac hypertrophy[J]. Circ Res, 2013, 112(4): 651-663. DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.112.279760.

[20] Sun B, Ding R, Yu W,etal. Advanced oxidative protein products induced human keratinocyte apoptosis through the NOX-MAPK pathway[J]. Apoptosis, 2016, 21(7): 825-835. DOI:10.1007/s 10495-016-1245-2.