三種免核酸提取PCR試劑盒檢測(cè)乙肝患者血清HBV-DNA的臨床對(duì)比研究

高潔 嚴(yán)敏 付婷 邵中軍

近年來(lái)，我國(guó)乙型肝炎患者人數(shù)呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)證實(shí)，引發(fā)該病的主要原因是乙型肝炎病毒感染，血液傳播是其最主要的傳播途徑[1]。針對(duì)乙型肝炎病毒，如何能夠準(zhǔn)確、迅速地作出診斷，及時(shí)治療尤為關(guān)鍵，血清中的乙型肝炎病毒是診斷乙型肝炎患者是否患病的最精準(zhǔn)、最可靠的指標(biāo)[2]。為了尋找最為科學(xué)、合理、有效的檢查手段，本研究選擇了3種免核酸提取PCR試劑盒對(duì)24例乙肝患者血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)選擇24例陰性血清作對(duì)比，比較3種試劑盒在乙肝病毒檢測(cè)中的臨床應(yīng)用效果?，F(xiàn)作如下報(bào)告。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)患者本人及其家屬同意，選取乙肝防治示范區(qū)于2015年1月—2016年6月檢測(cè)出的24例乙型肝炎患者血清標(biāo)本，24例患者包括14例男性和10例女性，年齡在24～51歲，平均年齡在（40.1±3.7）歲。以《病毒性肝炎防治方案》（2000年）為診斷標(biāo)準(zhǔn)，HBsAg、HBeAg檢測(cè)呈現(xiàn)陽(yáng)性或抗HBe、抗HBc呈現(xiàn)陽(yáng)性；另外要排除HAV、HCV、HDV、HEV感染病例。另外于我院體檢中心選擇24例陰性血清作為參比對(duì)照，包括14例男性和10例女性，年齡在21～49歲，平均年齡在（39.8±3.4）歲；經(jīng)HBsAg檢測(cè)均為陰性。

1.2 主要試劑

3種免核酸提取PCR試劑盒分別購(gòu)自A、B、C三家不同的公司；DL2000 DNA Marker（寶生物工程有限公司）；SYBGreenⅠ染料（廈門(mén)百維信）；乙肝病毒熒光定量試劑盒（上?？迫A生物科技公司）；引物由上海生工公司合成。

1.3 檢測(cè)方法

對(duì)24份乙肝患者血清及24份陰性血清，分別用3種免核酸提取PCR試劑盒單獨(dú)檢測(cè)。反應(yīng)體系（25 μl）組成如下：引物0.75 μl，酶 0.5 μl，2×PCR Buffer 12.5 μl，待測(cè)血清 2 μl，使用RNase-free water 加至25 μl。反應(yīng)條件如下：98℃ 2 min；98℃5 s，68℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)掃描成像記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

針對(duì)24例乙型肝炎患者血清檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種免核酸提取試劑盒中，購(gòu)自C公司的MightyAmp試劑盒陽(yáng)性檢出率最高，達(dá)到95.83%；3種試劑盒檢測(cè)下的陽(yáng)性結(jié)果經(jīng)RTPCR檢測(cè)，均為陽(yáng)性。另外，檢測(cè)24例陰性參比血清，結(jié)果顯示均為陰性。3種試劑盒陽(yáng)性檢出率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

目前，慢性乙型肝炎患者在我國(guó)乃至全世界占有很大比例，研究發(fā)現(xiàn)，大約有15%～40%的乙肝病毒攜帶者會(huì)出現(xiàn)一系列的并發(fā)癥，比如肝硬化、肝功能失常、腎衰竭等[3-4]。乙型肝炎的發(fā)生不僅嚴(yán)重危害患者自身的身體健康和生活質(zhì)量，還會(huì)增加患者家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)以及家屬精神壓力。

當(dāng)機(jī)體感染乙肝病毒時(shí)，外周血液乙肝病毒復(fù)制活動(dòng)開(kāi)始加劇，因此檢測(cè)血清中的乙肝病毒對(duì)于乙肝的診斷具有重要意義[5]。當(dāng)前臨床應(yīng)用的主要檢測(cè)方法是熒光定量PCR技術(shù)，這種診斷技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也存在一定的局限性[6]。熒光定量PCR方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度和特異度都比較高，但樣品前處理比較麻煩，需要進(jìn)行核酸提取并純化，耗時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)費(fèi)用較高[7]。

本研究選取3種免核酸提取PCR試劑盒，這樣就彌補(bǔ)了熒光定量PCR檢測(cè)方法的局限性，省略了核酸提取以及純化的步驟，采集患者血清后直接加入反應(yīng)體系，按照試劑盒說(shuō)明操作即可，簡(jiǎn)化了操作程序，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間，相比于熒光定量PCR檢測(cè)方法更加方便快捷[8]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，3種免核酸提取試劑盒中，購(gòu)自C公司的MightyAmp試劑盒陽(yáng)性檢出率最高，達(dá)到95.83%；3種試劑盒檢測(cè)下的陽(yáng)性結(jié)果經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，均為陽(yáng)性。另外，檢測(cè)24例陰性參比血清，結(jié)果顯示均為陰性。3種試劑盒陽(yáng)性檢出率分別為87.50%（21/24），91.67%（22/24），95.83%（23/24），3種試劑盒，兩兩相比，陽(yáng)性檢出率均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。綜合分析本試驗(yàn)，由于本次試驗(yàn)的樣本量較少，為了使免核酸提取PCR試劑盒應(yīng)用于乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒的臨床檢測(cè)分析這一方法更具有說(shuō)服力及可信度，下一步本試驗(yàn)欲將進(jìn)一步加大試驗(yàn)的樣本量。

表1 3種免核酸提取PCR試劑盒檢測(cè)乙型肝炎病毒結(jié)果[n（%）]

綜上所述，3種免核酸提取PCR試劑盒應(yīng)用于乙型肝炎病毒的檢測(cè)，具有檢測(cè)方便快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在乙型肝炎患者的臨床診斷中發(fā)揮重要作用。

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[2] 付林平. 2種免疫檢驗(yàn)方法檢測(cè)乙型肝炎病毒感染血清學(xué)標(biāo)志物的臨床研究[J]. 中外醫(yī)療，2017，36（32）：21-23.

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