不同菌肥對土壤養(yǎng)分、酶活性和微生物功能多樣性的影響

王夢雅，符云鵬*，賈 輝，張曉娟，趙兵飛，宋顯峰

土壤微生物是土壤有機質以及養(yǎng)分轉化和循環(huán)的動力，參與到土壤生態(tài)系統(tǒng)的各個環(huán)節(jié)[1]，通過添加菌肥來增加土壤微生物種群和數(shù)量已成為改善土壤質量常用的措施。菌肥施入土壤會使土壤微生物大量繁殖。微生物吸收肥料中的營養(yǎng)物質轉變?yōu)樽陨淼臋C體物質，之后死亡完成了無機養(yǎng)分有機化，可以減少淋溶和揮發(fā)造成的養(yǎng)分損失?，F(xiàn)如今，較為常用的菌肥為微生物菌劑和生物有機肥，其中微生物菌劑是經(jīng)過特殊工藝制成的含有活菌的制劑[2]；生物有機肥是由有益微生物活菌與有機肥結合制成的微生物有機復合肥料[3]。土著菌擴繁劑是近年來中國農業(yè)科學院煙草研究所最新研制的產品，它是利用馴化的高抗逆性微生物對大豆進行低溫有氧發(fā)酵后制成的一種有益的微生物田間擴繁劑，能迅速在肥料表面形成膠體膜，構成有益微生物培養(yǎng)基，從而使土著菌擴繁劑本身含有的微生物和土壤中本土微生物大量繁殖，但目前還未得到廣泛應用。

施用菌肥對土壤的影響雖已有大量的研究，但主要集中在單一菌肥不同施用量的研究[4-5]，對于不同菌肥施用后的效果對比分析相對薄弱。因此本試驗初步研究了向綠肥翻壓后的植煙土壤中施用微生物菌劑、土著菌擴繁劑、生物有機肥等菌肥后土壤的有機質和養(yǎng)分狀況，并重點研究了酶活性、土壤呼吸及微生物功能多樣性指標的變化，以期為制定優(yōu)質的施肥措施，提高土壤養(yǎng)分及生物性質提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地基本情況

試驗于2016年4—10月在平頂山市郟縣李口鎮(zhèn)進行，供試煙田為旱地，土壤為褐土，其基本理化性質為：有機質19.36 g/kg，速效氮87.13 mg/kg，速效磷14.28 mg/kg，速效鉀84.49 mg/kg。供試品種為當?shù)刂髟云贩N中煙100。

1.2 試驗設計

試驗設4個處理：CK，在黑麥草翻壓的基礎上常規(guī)施肥；T1、T2、T3分別在 CK的基礎上添加30 kg/hm2的微生物菌劑（有效微生物含量100億/g）、11.25 kg/hm2的土著菌擴繁劑（有效微生物含量80億/g，N、P2O5、K2O含量分別為3.72%、1.08% 、0.88%）、600 kg/hm2的生物有機肥（有效微生物含量2億/g，N、P2O5、K2O含量分別為1.82%、2.68% 、3.08%），菌肥的施用量按照產品介紹最優(yōu)施用量施入。試驗設3次重復，隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積為244.57 m2。試驗用微生物菌劑和生物有機肥為河南省鶴壁市禾盛生物科技有限公司提供，土著菌擴繁劑（商品名為納米酵豆）由中國農業(yè)科學院煙草研究所提供。黑麥草于2015年11月初播種，于2016年3月底翻壓，翻壓量為2.67 t/hm2。翻壓時全碳含量為34.9%，全氮含量為1.05%，全磷含量為0.21%，全鉀含量為2.37%。

常規(guī)施肥氮用量為30 kg/hm2，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1∶2∶9，其中煙草專用復合肥（10∶10∶20）用量為 30 kg/hm2，芝麻餅肥（4% N）675 kg/hm2，黃腐酸鉀（9.2% K2O）375 kg/hm2，磷、鉀不足部分分別由重過磷酸鈣（40% P2O5）和硫酸鉀（50%K2O）補充。黃腐酸鉀、硫酸鉀、重過磷酸鈣和70%芝麻餅肥作基肥條施，30%芝麻餅肥和煙草專用復合肥與菌肥混勻之后于移栽時穴施。各處理煙株行距1.2 m，株距0.5 m，于2016年5月3日移栽，2016年9月15日采收結束。田間煙草栽培管理措施按照平頂山市煙草種植標準化操作進行。

1.3 土樣采集與測定指標

煙株旺長期（移栽后60 d）每個小區(qū)多點混合采集0～20 cm土樣，一部分過2 mm篩后放于4 ℃冰箱保存用于測定土壤脲酶、蔗糖酶活性以及細菌功能多樣性；其余挑出根須、石頭等雜物后風干過不同目篩后分別用于測定土壤有機碳、堿解氮、速效鉀、速效磷的含量。

1.4 測定方法

土壤基本理化性質的測定采用常規(guī)方法[6]，有機碳采用重鉻酸鉀-外加熱法測定；采用堿解擴散法測定堿解氮含量；采用NaHCO3浸提鉬銻抗比色法測定速效磷含量；采用NH4OAC浸提火焰光度法測定速效鉀含量。脲酶采用靛酚比色法測定，其活性以24 h后土壤中生成的NH4+-N量表示；蔗糖酶用3,5-二硝基水楊酸比色法測定[7]，其活性以24 h后產生的葡萄糖的量來表示。

土壤呼吸在煙株旺長期（移栽后 60 d）采用Li-COR8100A土壤碳通量自動測量儀于晴朗無風天氣上午 9∶00—11∶00 測定[8]。

細菌代謝功能多樣性的檢測[9]，采用 96孔BIOLOGECO板進行培養(yǎng)試驗，其含有31種碳源，25 ℃恒溫培養(yǎng)，在24、48、72、96、120 h后測定各孔在590 nm波長下的光吸收值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excle 2013、SPSS 20.0和R語言進行數(shù)據(jù)分析和處理，采用origin 9.0進行繪圖。

對于Biolog數(shù)據(jù)，選取培養(yǎng)120 h的結果進行分析，利用平均顏色變化率（AWCD）來反映微生物活性，利用Shannon指數(shù)來反映群落物種的豐富度，利用Simpson指數(shù)來反映土壤微生物群落的優(yōu)勢度，利用Mcintosh指數(shù)來表征微生物群落的均勻度。

計算公式如下[10]：

AWCD=∑(Ci-R)/31

式中，Ci為每孔在590 nm下的吸光值，R為ECO板上對照孔Ai的吸光值，31為ECO板上碳源的種類數(shù)。Ci-R＜0 的孔，全記為零；

Shannon 指數(shù)=-∑pi×logpi

式中，pi為第i孔相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率；

Mcintosh指數(shù)＝(∑ni2)1/2

式中，ni為第i個碳源孔的相對OD值（即Ci-R），該試驗中為31；

Simpson指數(shù)＝1-∑pi2

式中，pi為第i孔相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率。

2 結 果

2.1 不同菌肥對土壤有機碳和速效養(yǎng)分的影響

由表1看出，施入菌肥后的處理除堿解氮以外的各養(yǎng)分含量較CK均顯著提高，并且以T2處理增加量最大，有機碳、速效磷、速效鉀含量分別增加了7.82%、39.19%、48.95%。T2堿解氮含量顯著低于CK，其他處理間差異不顯著。

2.2 不同菌肥對土壤主要酶活性的影響

圖 1表明，脲酶活性表現(xiàn)為T2＞T3＞T1＞CK，其中T2和T3脲酶活性無顯著差異。圖2表明，施用菌肥處理的蔗糖酶活性均顯著高于對照，且以T3處理最高，較對照增加了93.8%。

表1 不同處理土壤有機碳和速效養(yǎng)分Table1 Soil organic carbon and available nutrients in different treatments

圖1 不同處理對脲酶活性的影響Fig. 1 Effect of different treatments on urease activity

圖2 不同處理對蔗糖酶活性的影響Fig. 2 Effect of different treatments on invertase activity

2.3 不同菌肥對土壤微生物功能多樣性的影響

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，AWCD值先迅速增加，72 h后緩慢上升。雖然各個處理微生物對碳源利用的總能力隨培養(yǎng)時間的增加而增加，但增加的速度卻不一致，培養(yǎng)前期以 T2增長速率最快，后期則以 T3的增長速率較快，但結果仍以T2的AWCD值最大。

圖3 微生物在培養(yǎng)過程中AWCD的變化Fig. 3 Changes of average well color development (AWCD)of microorganism under culturing time

由表2可知，不同菌肥對土壤微生物物種的豐富度無顯著影響。Simpson指數(shù)和Mcintosh指數(shù)均表現(xiàn)為 T2＞T3＞T1＞CK，由此可見，添加土著菌擴繁劑顯著增強了微生物群落中常見物種對碳源的利用能力以及微生物群落整體對碳源的利用程度。

表2 不同處理土壤微生物功能多樣性指數(shù)Table 2 Soil microbial function diversity index of different treatments

2.4 主成分分析

對土壤主要的生物、化學指標進行主成分分析，結果如表3所示。其中，第一主成分的方差占所有主成分方差的39.348%，前2個主成分的累積方差貢獻率已達到67.053%，因此前2個主成分已經(jīng)可以反映土壤的肥力狀況。

表3 各處理土壤生態(tài)生物學性狀指示公因子方差及其主成分的特征值和累積貢獻率Table 3 Soil ecosystem physical and chemical indexes and eigenvalues and cumulative contribution of principle components of different treatments

因子載荷反映了主成分與生物化學指標間的相關程度，因子載荷絕對值越大，表明該指標對主成分的影響越大。圖4表明，本研究PC1中微生物功能多樣性指數(shù)的因子載荷絕對值均大于0.6，PC2的因子載荷絕對值在0.6以上的有4種：蔗糖酶、有機碳、速效鉀和速效磷，綜合分析，微生物功能多樣性、蔗糖酶活性和有機碳含量為施入菌肥后變化幅度較大的土壤指標。由圖4還可看出脲酶的活性與微生物的優(yōu)勢度和均勻度呈顯著正相關關系，蔗糖酶的活性與有機碳含量呈現(xiàn)正相關關系。

2.5 不同菌肥對土壤呼吸速率的影響

土壤呼吸是指通過根呼吸、土壤中動物呼吸以及微生物對凋落物和土壤有機質分解釋放CO2的生態(tài)系統(tǒng)過程。由圖5可知，不同處理煙株旺長期土壤呼吸速率表現(xiàn)為 T2＞T3＞T1＞CK，且各處理間差異達到顯著水平。

3 討 論

土壤有機碳是土壤碳庫重要的組成部分，其含量是反映土壤質量的重要因素[11]。本研究結果表明，配施菌肥可以顯著提高土壤有機碳的含量，這與逢煥成等[12]的研究結果相同。添加菌肥會增加綠肥的腐解程度，同時促進了煙株根系的生長，使根系分泌物增加，從而增加有機碳的含量。

胡誠[13]、陳哲等[14]研究發(fā)現(xiàn)，施入生物有機肥或微生物菌肥后增加了土壤中速效鉀和速效磷的含量。本研究結果與前人研究結果一致，一方面菌肥中本身含有的養(yǎng)分增加了速效磷和速效鉀的含量，另一方面施入菌肥顯著增加了土壤微生物的數(shù)量和活性，促進黑麥草中有機化合物的礦化，產生煙株可利用的速效磷和速效鉀。孫薇等[15]研究發(fā)現(xiàn)，施用菌肥后土壤中的氮含量高于未施用菌肥的土壤，而本文的研究結果與之相反，施入菌肥后堿解氮的含量反而降低，主要是由于活性較高的微生物將較多的土壤氮轉化為自身體內的有機氮，降低了土壤速效氮的含量。

艾童非等[4]，劉芳等[16]研究發(fā)現(xiàn)，施用微生物菌劑能顯著提高土壤脲酶和土壤蔗糖酶的活性。本研究也取得了同樣的結果。由于配施菌肥能加速黑麥草中有機化合物的分解，提供了酶促反應的底物，從而促進了微生物的分解，而土壤酶是微生物生長代謝的產物[17]。

圖4 主成分分析因子載荷圖Fig. 4 Loadings of principal component analysis

圖5 不同處理對土壤呼吸速率的影響Fig. 5 Effects of different treatments on soil respiration rate

土壤微生物功能多樣性既代表了土壤的生物活性，又可以反映出微生物群落的生態(tài)特征[18]。張志剛等[19]研究發(fā)現(xiàn)，蔬菜殘株配施生物菌肥可顯著提高微生物對碳源的利用能力，本研究結果同樣表明，施入菌肥使土壤微生物對碳源的利用能力增強。一方面由于菌肥本身含有的微生物增加了土壤中微生物的數(shù)量和活性，另一方面菌肥的施入帶入了有機質和養(yǎng)分，并且加速了黑麥草中有機化合物的礦化分解，增加了土壤中的養(yǎng)分含量，使微生物在養(yǎng)分豐富的條件下生長迅速。由Simpson 指數(shù)可知，配施菌肥增加了土壤中常見微生物物種的豐富度；由 Mcintosh 指數(shù)可知，配施菌肥增加了土壤中微生物群落的均勻度。

武欣等[20]研究結果顯示，有機肥配施菌肥可顯著提高土壤呼吸速率，本研究也取得了同樣的結果。施入菌肥后增加了微生物的數(shù)量，使微生物氧化有機物的能力增強，同時微生物活動也可緩解土壤板結程度，促進根系發(fā)育，根系呼吸能力增強，有機質含量的顯著提高也是增大土壤呼吸速率的重要因素。配施土著菌擴繁劑的處理，不是單純向土壤施入微生物菌體，而是與肥料結合形成有益微生物的培養(yǎng)基，減弱了土壤微生態(tài)環(huán)境和土著微生物競爭對外施微生物的不利影響，使外施和土著微生物均得以充分繁殖生長，從而提高了土壤有機質和速效磷、鉀的含量，增強了土壤酶活性，改善了植煙土壤微生物功能多樣性，對植煙土壤質量的提高有著積極的作用。

4 結 論

本研究結果表明，配施不同菌肥顯著增加了土壤有機碳和速效養(yǎng)分的含量，提高了土壤脲酶和蔗糖酶的活性，對土壤微生物功能多樣性以及土壤呼吸速率的提高有明顯的效果。其中以配施土著菌擴繁劑對植煙土壤養(yǎng)分以及生物性質提升效果最為明顯。

[1] 李云，孫波，李忠佩，等. 不同氣候條件對旱地紅壤微生物群落代謝特征的長期影響[J]. 土壤，2011，43（1）：60-66.LI Y, SUN B, LI Z P, et al. Long-term effects of different climatic conditions on microbial metabolic properties in red Soil[J]. Soils, 2011, 43(1)∶ 60-66.

[2] 楊玉新，王純立，謝志剛，等. 微生物肥對土壤微生物種群數(shù)量的影響[J]. 新疆農業(yè)科學，2008，45（S1）：169-171.YANG Y X, WANG C L, XIE Z G, et al. The influence of the microbial fertilizer on microbial population density in soil[J]. Xinjiang Agricultural Sciences, 2008, 45(S1)∶169-171.

[3] 周莉華，李維烔，倪水珍. 長期施用EM生物有機肥對冬小麥生產的影響[J]. 農業(yè)工程學報，2005，21（S1）：221-224.ZHOU L H, LI W J, NI S Z. Effects of long-term application of EM biological-organic fertilizer on winter wheat production[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2005, 21(S1)∶ 221-224.

[4] 艾童非，楊鵬九，費洪波，等. 微生物菌劑有機肥對植煙土壤環(huán)境及烤煙產質量的影響[J]. 安徽農業(yè)科學，2016，44（18）：99-102，119.AI T F, YANG P J, FEI H B, et al. Effect of applying microbial inoculum organic fertilizer on tobacco growing soil environment and yield, quality of flue-cured tobacco[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2016,44(18)∶ 99-102,119.

[5] 李嬌，劉國順，高琴，等. 不同生物有機肥與煙草專用復合肥配施對烤煙根際土壤微生物及土壤酶活性的影響[J]. 河南農業(yè)大學學報，2013，47（2）：132-137.LI J, LIU G S, GAO Q, et al. Effect of application of different bio-organic fertilizer with tobacco specific chemical fertilizer on the amount of microbe and enzyme activities in the rhizosphere soil of flue-cured tobacco[J].Journal of Henan Agricultural University, 2013, 47(2)∶132-137.

[6] 魯如坤. 土壤農業(yè)化學分析方法[M]. 北京：中國農業(yè)科技出版社，2000.LU R K. Soil agrochenistry analysis protocols[M].Beijing∶ China Agriculture Science Press, 2000.

[7] 關松蔭. 土壤酶及其研究法[M]. 北京：農業(yè)出版社，1983.GUAN S Y. Soil enzyme and its research method[M].Beijing∶ Agriculture Press, 1983.

[8] 孟春，王立海，沈微. 擇伐對小興安嶺地區(qū)針闊混交林土壤呼吸溫度敏感性的影響[J]. 林業(yè)科學，2011，47（3）：102-106.MENG C, WANG L H, SHEN W. Effect of sensitivity of soil respiration to soil temperature in a coniferbroadleave forest in Xiaoxing'an Mountain after select cutting[J]. Scientia Silvae Sinicae, 2011, 47(3)∶ 102-106.

[9] Garland J L．Mills A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on basis of patterns of community level sole-carbonsource utilization[J]. Applied Environmental Microbiology, 1991, 57∶ 2351-2359.

[10] 董立國，袁漢民，李生寶，等. 玉米免耕秸稈覆蓋對土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學報，2010，19（2）：444-446.DONG L G, YUAN H M, LI S B, et al. Influence on soil microbial community functional diversity for maize no-tillage with straw mulch[J]. Ecology and Environment Sciences, 2010, 19(2)∶ 444-446.

[11] 郝瑞軍，李忠佩，車玉萍，等. 凍融交替對水稻土水溶性有機碳含量及有機碳礦化的影響[J]. 土壤通報，2007，38（6）：1052-1057.HAO R J, LI Z P, CHE Y P, et al. Effects of freezing and thawing cycles on the contents of WSOC and the organic carbon mineralization in paddy soil[J]. Chinese Journal of Soil Science, 2007, 38(6)∶ 1052-1057.

[12] 逢煥成，李玉義，嚴慧峻，等. 微生物菌劑對鹽堿土理化和生物性狀影響的研究[J]. 農業(yè)環(huán)境科學學報，2009，28（5）：951-955.PANG H C, LI Y Y, YAN H J, et al. Effects of inoculating different microorganism agents on the improvement of salinized soil[J]. Journal of Agroenvironment Science, 2009, 28(5)∶ 951-955.

[13] 胡誠，曹志平，羅艷蕊，等. 長期施用生物有機肥對土壤肥力及微生物生物量碳的影響[J]. 中國生態(tài)農業(yè)學報，2007，15（3）：48-52.HU C, CAO Z P, LUO Y R, et al. Effect of long-term application of microorganismic compost or vermicompost on soil fertility and microbial biomass carbon[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2007, 15(3)∶ 48-52.

[14] 陳哲，趙永鋒，張建嶺，等. 長期施用復合微生物肥對農田土壤速效養(yǎng)分的影響[J]. 現(xiàn)代農業(yè)科技，2014（19）：241-245.CHEN Z, ZHAO Y F, ZHANG J L, et al. Effect of long-term applying compound microbial fertilizer on soil available nutrients in farmland[J]. Modern Agricultural Sciences and Technology, 2014（19）: 241-245.

[15]孫薇，錢勛，付青霞，等. 生物有機肥對秦巴山區(qū)核桃園土壤微生物群落和酶活性的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學報，2013，19（5）：1224-1233.SUN W, QIAN X, FU Q X, et al. Effects of bio-organic fertilizer on soil microbial community and enzymes activities in walnut orchards of the Qinling-Bashan Region[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer, 2013,19(5): 1224-1233.

[16]劉芳，韓丹，趙銘欽，等. 微生物菌劑配施腐殖酸鉀對植煙土壤改良及烤煙經(jīng)濟效益的影響[J]. 浙江農業(yè)學報，2017，29（7）：1064-1069.LIU F, HAN D, ZHAO M Q, et al. Effects of application of microbial agents along with humic acid potassium on tobacco-planted soil and economic benefit of flue-cured tobacco[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis, 2017, 29(7):1064-1069.

[17]翟修彩，劉明，李鐘佩，等. 不同添加劑處理秸稈腐解物對紅壤性質的影響[J]. 土壤，2013，45（5）：868-874.ZHAI X C, LIU M, LI Z P, et al. Effects of different additives promoted straw decomposition on red soil property[J]. Soils, 2013, 45(5): 868-874.

[18]栗方亮，李忠佩，劉明，等. 肥際氮素濃度下添加不同碳源對水稻土微生物特性的影響[J]. 土壤學報，2012，49（5）：971-978.LI F L, LI Z P, LIU M, et al. Effects of addition of carbon on microbial properties as affected by source of carbon and N concentration at fertisphere in paddy soil[J]. Acta Pedologica Sinica, 2012, 49(5): 971-978.

[19]張志剛，董春娟，高蘋，等. 蔬菜殘株、生物菌肥施用下日光溫室辣椒土壤微生物學特征[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學報，2011，17（3）：710-717.ZHANG Z G, DONG C J, GAO P, et al. Soil microbiologic characteristics under vegetable residues and bacterial manure application in greenhouse[J]. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2011, 17(3): 710-717.

[20]武欣，孟會生，栗麗，等. 不同肥料配施對復墾土壤呼吸及微生物量碳氮的影響[J]. 山西農業(yè)大學學報（自然科學版），2017，37（1）：48-53.WU X, MENG H S, LI L, et al. Effect of soil respiration and microbial biomass CN of reclamation soil with application of three fertilizers in the collapse mining area[J]. Journal of Shanxi Agricultural University(Natural Science Edition), 2017, 37(1): 48-53.