Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌患者外周血中的表達(dá)及臨床意義

陳國飛，楊華，蔣幸新，王波，徐艷

（1.江蘇省蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 蘇州 215000；2.江蘇省蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 內(nèi)四科，江蘇 蘇州 215000；3.江蘇省蘇州市吳中人民醫(yī)院 內(nèi)科，江蘇 蘇州 215128）

胃癌是世界上最為普遍的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，每年約有70萬人死于胃癌，位居所有腫瘤的第2位[1]。在我國胃癌發(fā)病率遠(yuǎn)高于西方國家，是我國發(fā)病率第2高的惡性腫瘤，死亡率也高居第3位[2-3]。胃癌患者預(yù)后較差，大部分患者初次就診時(shí)腫瘤已處于晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]。因此，胃癌的5年生存率僅為40%左右，其中大約5%的胃癌患者發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移[4-6]。近年來，隨著診治水平的提高，胃癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐步下降，但如何提高胃癌的早期診斷率及改善胃癌患者的術(shù)后生活質(zhì)量仍是全球性的科研難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

Survivin是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制分子，在多種惡性腫瘤中廣泛表達(dá)，與腫瘤的惡性表型及不良預(yù)后密切相關(guān)[7-8]。CK19片段CYFRA 21-1也被證實(shí)是乳腺癌[9]、非小細(xì)胞肺癌[10-11]和結(jié)腸癌[11]等多種腫瘤的血清診斷標(biāo)志物。但胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的診斷和預(yù)后價(jià)值目前尚未得到充分研究。本研究擬通過RT-PCR檢測胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表達(dá)水平，并聯(lián)合分析Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌早期診斷和判斷預(yù)后中的臨床意義，為胃癌早期診斷和個(gè)體化治療尋找有效分子指標(biāo)以及奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對(duì)象 2007年5月-2010年12月于蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院就診的胃癌患者89例以及同期健康對(duì)照89例，所有入選患者的臨床病理資料完整。病例納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①經(jīng)病理組織學(xué)確診為胃癌，且均為初診初治患者；②入組患者術(shù)前均未接受放、化療及生物治療；③入組患者肝腎功能未見明顯異常；④未合并其他腫瘤或嚴(yán)重內(nèi)科疾病。入組患者術(shù)前空腹采血5 ml，枸櫞酸鈉抗凝去酶的采血管中保存。經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選本課題的胃癌患者均同意使用其外周血標(biāo)本用于科學(xué)研究并簽署知情同意書。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 Survivin和CK19引物由上海吉瑪科技有限公司合成，血液總RNA試劑盒購自北京天根科技有限公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，SYBR Premix試劑盒購自TaKaRa公司；主要儀器如下：美國Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀，Thermo公司 -80℃冰箱，海爾公司-20℃冰箱，德國Eppendorf公司臺(tái)式低溫高速離心機(jī)。

1.2 外周血Survivin mRNA和CK19 mRNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄

外周血總RNA提取方法參照北京天根科技有限公司的血液總RNA提取試劑盒所述步驟。紫外分光儀檢測RNA濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄步驟參照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒所述步驟，每個(gè)逆轉(zhuǎn)錄體系中含有10 ng的RNA模板。逆轉(zhuǎn)錄條件為：30℃ 10 min，42℃50 min，95℃ 5 min，反應(yīng)產(chǎn)物儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）條件為：95℃5 min，94℃ 30 s，72℃ 60 s，循環(huán)40次，最后72℃5 min， Survivin mRNA復(fù)性溫度62℃30s，CK19 mRNA復(fù)性溫度63℃ 30 s。采用相對(duì)定量法計(jì)算外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（F），F(xiàn)=2-ΔCt，ΔCt=Ct miR-17-5p-CtU6，Ct為每個(gè)反應(yīng)管熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，采用Speraman相關(guān)分析，外周血Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌患者中的診斷價(jià)值采用ROC曲線，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，各組間生存差異比較采用Log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin和CK19在胃患者外周血中的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，健康對(duì)照中Survivin的表達(dá)水平為（1.871±1.317），胃癌患者外周血中Survivin表達(dá)水平為（8.131±4.182），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.195，P=0.019）；健康對(duì)照中CK19的表達(dá)水平為（1.018±0.819），胃癌患者外周血中CK19表達(dá)水平為（13.256±7.518），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.013，P=0.003）。89例胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組。見圖1。

圖1 胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表達(dá)水平

2.2 外周血Survivin mRNA和CK19 mRNA的診斷價(jià)值

根據(jù)89例胃癌患者和健康對(duì)照外周血中Survivin和CK19 mRNA的表達(dá)水平分別繪制ROC曲線。結(jié)果顯示，Survivin的ROC曲線下面積為0.8305（95%CI：0.784，0.887），敏感性為78.151%，特異性為85.394%，對(duì)應(yīng)診斷界值為7.875（圖2A）；CK19的ROC曲線下面積為0.8149（95%CI：0.761，0.899），敏感性為73.157%，特異性為81.825%，對(duì)應(yīng)診斷界值為8.114（圖2B）。兩者聯(lián)合檢測并聯(lián)試驗(yàn)可提高敏感性至92.136%，串聯(lián)實(shí)驗(yàn)可提高特異性之97.751%，高于任一單一指標(biāo)的檢測，提示外周血中的Survivin mRNA和CK19 mRNA表達(dá)水平在胃癌患者中均具有較高的診斷價(jià)值。

圖2 胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的診斷價(jià)值

2.3 外周血Survivin mRNA的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

χ2檢驗(yàn)顯示，外周血Survivin mRNA的表達(dá)與胃癌患者的TNM分期正相關(guān)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著TNM分期的進(jìn)展，外周血中Survivin mRNA的表達(dá)水平亦逐漸升高。而外周血Survivin的表達(dá)與患者的年齡、性別、Lauren分型等臨床病理特征無相關(guān)。見表1。

2.4 外周血CK19 mRNA的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

χ2檢驗(yàn)顯示，外周血CK19 mRNA的表達(dá)與胃癌患者的TNM分期正相關(guān)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著TNM分期的進(jìn)展，外周血中CK19 mRNA的表達(dá)水平亦逐漸升高。而外周血CK19 mRNA的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、Lauren分型等臨床病理特征無相關(guān)。見表2。

2.5 外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA表達(dá)水平與胃癌患者術(shù)后5年生存率的關(guān)系

根據(jù)外周血中Survivin mRNA表達(dá)水平，將胃癌患者分為Survivin高表達(dá)組和Survivin低表達(dá)組。Kaplan-Meier生存曲線顯示，Survivin高表達(dá)組的胃癌患者的術(shù)后5年總體生存率低于Survivin低表達(dá)組（P＜0.05）。而后，根據(jù)外周血中CK19 mRNA表達(dá)水平，將胃癌患者分為CK19高表達(dá)組和CK19低表達(dá)組。Kaplan-Meier生存曲線顯示，CK19高表達(dá)組的胃癌患者的術(shù)后5年總體生存率低于CK19低表達(dá)組（P＜0.05）。最后，根據(jù)胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表達(dá)水平，將胃癌患者分為Survivin+CK19+組、Survivin+CK19-組、Survivin-CK19+組和Survivin-CK19-組，利用K-M曲線分析4組胃癌患者術(shù)后5年生存率的差異，結(jié)果顯示，Survivin+CK19+組胃癌患者術(shù)后5年生存率低于其他各組，Survivin-CK19-組胃癌患者術(shù)后5年生存率高于其他各組（P＜0.05）。見圖3。

表1 外周血Survivin mRNA表達(dá)水平與89例胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系 例

表2 外周血CK19 mRNA表達(dá)水平與89例胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系 例

圖3 胃癌患者外周血中Survivin mRNA和/或CK19 mRNA表達(dá)與患者術(shù)后5年生存率的關(guān)系

3 討論

循環(huán)腫瘤細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的元兇，檢測腫瘤患者外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞有助于動(dòng)態(tài)監(jiān)測腫瘤治療效果及預(yù)測預(yù)后。Survivin是近年來發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，定位于17q25染色體，其特異性地高表達(dá)于腫瘤組織，與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)[12]。CK19是國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的檢測上皮來源腫瘤患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞表達(dá)情況的生物標(biāo)志物[12]。Survivin和CK19是常用的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的鑒定標(biāo)志物。本研究利用RT-PCR檢測了Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌患者外周血的表達(dá)水平，并進(jìn)一步研究了Survivin mRNA和CK19 mRNA與胃癌患者早期診斷、臨床病理特征和術(shù)后生存率之間的關(guān)系。本研究顯示胃癌患者外周血中Survivin mRNA的表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，提示了Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌早期診斷中的潛在價(jià)值。因此，利用ROC曲線進(jìn)一步檢測Survivin mRNA和CK19 mRNA的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示Survivin mRNA和CK19 mRNA均為胃癌早期診斷的有效分子指標(biāo)。更為重要的是，聯(lián)合檢測Survivin mRNA和CK19 mRNA在胃癌患者外周血中表達(dá)可進(jìn)一步提高胃癌早期診斷的敏感性或特異性，可避免單一檢測帶來的假陽性和假陰性等局限性。

研究證實(shí)，胃癌患者腹腔灌洗液中Survivin的表達(dá)水平與胃癌患者腫瘤浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)[13]。而關(guān)于CK19與胃癌臨床病理特征的關(guān)系目前尚存在爭議。既往研究采用RT-PCR檢測胃癌患者外周血中CK19 mRNA在胃癌中的表達(dá)及臨床意義，發(fā)現(xiàn)CK19 mRNA與胃癌患者的年齡、性別和TNM分期等病理特征無相關(guān)[14]。另有研究利用免疫熒光法檢測CK19在外周血中的表達(dá)表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)外周血中CK19的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤部位、TNM分期和腫瘤分化程度無關(guān)。然而本研究顯示Survivin mRNA和CK19 mRNA與胃癌患者的TNM分期呈正相關(guān)[15]。各實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的可能原因?yàn)閷?shí)驗(yàn)方法敏感性和特異性的差異以及不同的病例群。為了進(jìn)一步明確胃癌患者外周血中CK19與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系，急需進(jìn)一步的大病例群前瞻性研究。

既往研究顯示，外周血CK19 mRNA陽性的患者術(shù)后5年生存率低于CK19 mRNA陰性組[14]，且CK19陽性或Survivin陽性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，是判斷胃癌患者預(yù)后和復(fù)發(fā)獨(dú)立的分子指標(biāo)[16-17]。值得注意的是，也有研究報(bào)道CK19 mRNA的表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后并無相關(guān)[18]。為了進(jìn)一步明確外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，本研究進(jìn)一步分析了2者單獨(dú)和聯(lián)合檢測在胃癌患者預(yù)后判斷中的價(jià)值。本研究結(jié)果證實(shí)Survivin mRNA和/或CK19 mRNA陽性的胃癌患者術(shù)后5年生存率低于Survivin mRNA和/或CK19 mRNA陰性組。更為重要的是，聯(lián)合分析2者表達(dá)與胃癌術(shù)后5年生存率的關(guān)系顯示，Survivin+CK19+組胃癌患者術(shù)后5年生存率低于其他各組，Survivin-CK19-組胃癌患者術(shù)后5年生存率高于其他各組，提示聯(lián)合檢測2者表達(dá)水平更有助于判斷胃癌患者預(yù)后并制定個(gè)體化治療方案。

綜上所述，本研究證實(shí)了胃癌患者外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA表達(dá)高于健康對(duì)照組；外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA均為有效的胃癌早期診斷的分子指標(biāo)；外周血中Survivin mRNA和CK19 mRNA的表達(dá)水平與胃癌的TNM分期呈正相關(guān)，而與年齡、性別、及Lauren分型等臨床病理特征無相關(guān)；Survivin+CK19+組胃癌患者術(shù)后5年生存率低于其他各組，Survivin-CK19-組胃癌患者術(shù)后5年生存率高于其他各組。本研究為胃癌發(fā)生及進(jìn)展的基礎(chǔ)研究奠定了一定的前期基礎(chǔ)，為胃癌的早期診斷及個(gè)體化治療提供了潛在的分子靶點(diǎn)。

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