大鼠肺纖維化和活性維生素D3干預(yù)后P32和PKD1的表達(dá)及作用研究

倪娜，劉乃國(guó)，高海洋，鄭靜，董洪亮，王楠

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2.急診EICU，山東 濱州 256603）

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（idiopathic pulmonary interstitial fibrosis，IPIF）是一種以彌漫性肺泡炎和成纖維細(xì)胞病理性增生，最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為特征的疾病[1]。目前病因不明，病程進(jìn)展緩慢。近年來(lái)通過(guò)大量的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧化/抗氧化失衡，在IPIF的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。TEIXEIRA[2]研究發(fā)現(xiàn)在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型中，給予抗氧化藥物N-乙酰半胱氨酸治療可以減輕肺纖維化程度。

PATRICK等[3]研究發(fā)現(xiàn)活性維生素D3（VD3）具有抗氧化作用，在氧自由基誘導(dǎo)的生物損傷中，可以保護(hù)細(xì)胞免受活性氧增加和氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞死亡。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致絲/蘇氨酸激酶蛋白激酶D1（protein kinase d1，PKD1）及其所調(diào)控的PKD1/MnSOD線粒體抗氧化信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)升高，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞器和細(xì)胞免受線粒體氧化應(yīng)激帶來(lái)的損傷和細(xì)胞死亡[4-5]。透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白（P32），是一個(gè)分子量為32 kD的多功能蛋白[6]。STORZ[7]報(bào)道，P32可以與PKD1結(jié)合并對(duì)PKD1在線粒體中的定位和功能具有調(diào)節(jié)作用。P32在肺纖維化中的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討P32蛋白和PKD1在肺纖維化發(fā)生中的表達(dá)及其相互作用，以及活性VD3在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中是否通過(guò)P32蛋白和PKD1相關(guān)信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性SD大鼠，購(gòu)自魯抗醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重180～200 g[許可證號(hào)：SCXK（魯）20130001]。

活性VD3[1，25（OH）2VD3]（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：#074M4028V），博來(lái)霉素（日本化藥株式會(huì)社，15 mg/瓶，批號(hào)：030201），羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），DNA/RNA/蛋白質(zhì)提取試劑盒（美國(guó)OMEGA公司，R6734-01），HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒（北京康為世紀(jì)公司，CW2582-100），實(shí)時(shí)定量試劑盒（瑞士羅氏公司，06924204001），內(nèi)參基因GAPDH引物購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司（B661204），PCR引物由上海生物工程技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，P32（1∶75，sc-23885）單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），PKC mu（phosphor Y463）（1 ∶ 250，ab59415）多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），超敏二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑（PV-9001/2）、DAB試劑盒（ZLI-9019）（中杉金橋公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf梯度PCR儀（德國(guó)艾本德股份公司，mastercycler 5333），實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad伯樂(lè)公司，CFX96），GeneQuant紫外分光光度計(jì)（美國(guó)通用電氣公司，GE1300），奧林巴斯顯微照相系統(tǒng)（日本奧林巴斯株式會(huì)社，BX51），凝膠成像分析系統(tǒng)（北京六一公司，WD9413C）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與處理 將90只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3個(gè)組，對(duì)照組、模型組和治療組。模型組氣管暴露后一次性注射博來(lái)霉素（5 mg/kg）[8]，并于術(shù)后第2天腹腔注射VD3溶劑（99.9%丙二醇和0.1%乙醇，1μl/g）；治療組同模型組一樣復(fù)制肺纖維化模型，于手術(shù)后第2天腹腔注射活性VD3（2μg/kg）[9]；對(duì)照組暴露氣管后注射滅菌生理鹽水（500μl/kg），并于術(shù)后第2天腹腔注射生理鹽水（1μl/g），各組均注射1次/2 d。各組動(dòng)物分別在術(shù)后第14、21、28天處死取材，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只大鼠。

1.3.2 HYP的含量測(cè)定 將肺組織在液氮中搗成粉末，按100 mg粉末加入1 ml生理鹽水的比例制備組織勻漿，用堿水解法按說(shuō)明書(shū)測(cè)定肺組織HYP濃度。

1.3.3 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）檢測(cè)肺組織中PKD1和P32 mRNA表達(dá) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取大鼠的總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以GAPDH作為內(nèi)參基因，用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）檢測(cè)各組大鼠肺組織中P32和PKD1 mRNA的表達(dá)，用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量。反應(yīng)體系為20μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 10 min；變性95℃ 15 s、退火60℃ 20 s、延伸72℃ 10 s，39個(gè)循環(huán)。引物見(jiàn)表1，擴(kuò)增曲線及熔解曲線見(jiàn)圖1。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中P32和PKD1蛋白表達(dá)水平 取各組肺組織，經(jīng)多聚甲醛固定、脫水、透明處理后，進(jìn)行石蠟包埋。切片厚度為4μm，常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，去除內(nèi)源性過(guò)氧化酶，37℃封閉30 min。滴加一抗，37℃孵育2 h，洗滌。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)滴加相應(yīng)二抗，洗滌。DAB顯色，洗滌，蘇木素復(fù)染。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下進(jìn)行組織觀察分析。以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆?；虬邏K為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.5 圖像分析 每例標(biāo)本每個(gè)指標(biāo)選取3～5個(gè)無(wú)重疊的陽(yáng)性表達(dá)視野（×200），利用Motic Med 6.0彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測(cè)定各目的蛋白陽(yáng)性目標(biāo)的平均光密度值，量化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件處理，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析及單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 基因P32、PKD1及GAPDH的擴(kuò)增及熔解曲線

2 結(jié)果

2.1 HYP含量

3組HYP在不同時(shí)間點(diǎn)上的含量進(jìn)行重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果顯示，不同組別之間HYP含量有差別（F=234.23，P=0.000），不同時(shí)間點(diǎn)HYP含量之間有差別（F=9.912，P=0.003），變化趨勢(shì)有差別（F=2.935，P=0.042）。見(jiàn)表2和圖2。

3組在不同時(shí)間點(diǎn)的HYP含量采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示，模型組和治療組在各時(shí)間點(diǎn)的HYP含量均比其相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組的HYP含量升高（P＜0.05）；治療組在各時(shí)間點(diǎn)的HYP含量與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組相比都降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 P32和PKD1 mRNA表達(dá)

對(duì)照組、模型組和治療組在不同時(shí)間點(diǎn)的P32和PKD1 mRNA表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢測(cè)，結(jié)果顯示，第14天，這2種細(xì)胞因子在模型組和治療組中的表達(dá)與對(duì)照組比較均降低，而治療組中的表達(dá)高于模型組中的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。第21天，模型組和治療組中這兩種細(xì)胞因子的表達(dá)與對(duì)照組比較均升高，治療組中P32 mRNA的表達(dá)量比模型組中升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而PKD1 mRNA的表達(dá)量在治療組和模型組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第28天，這2種細(xì)胞因子的表達(dá)在模型組和治療組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而治療組中的表達(dá)雖然高于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表3）。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，P32和PKD1的mRNA表達(dá)量之間具有相關(guān)性（r=0.861，P＜0.05）。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)3組大鼠肺組織中HYP的含量比較 （n=10，±s，μg/g）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)3組大鼠肺組織中HYP的含量比較 （n=10，±s，μg/g）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05

組別 第14天 第21天 第28天對(duì)照組 481±102 452±127 475±129模型組 832±1371） 1 025±741） 1 182±751）治療組 650±701）2） 820±1281）2） 858±851）2）

圖2 各組在不同時(shí)間點(diǎn)HYP含量變化

2.3 P32和PKD1的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞因子PKD1和P32在各組肺組織中的表達(dá)分布一致，都是主要在肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、纖維化肺泡隔中表達(dá)較高，在成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中無(wú)明顯表達(dá)。見(jiàn)圖3。

實(shí)驗(yàn)第14、21、28天，對(duì)檢測(cè)的2個(gè)基因的蛋白表達(dá)量，進(jìn)行重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)之間P32和PKD1的蛋白表達(dá)量有差別（F=18.826和45.047，均P=0.000）；不同組之間P32和PKD1的蛋白表達(dá)量有差別（F=4.002和8.532，P=0.049和0.006）；變化趨勢(shì)有差別（F=4.440和4.970，P=0.009 和 0.005），見(jiàn)圖4、5。

表3 P32 和 PKD1 mRNA 表達(dá)水平比較 （2-ΔΔCT，n=10，±s）

表3 P32 和 PKD1 mRNA 表達(dá)水平比較 （2-ΔΔCT，n=10，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與模型組比較，P＞0.05

PKD1第14天 第21天 第28天 第14天 第21天 第28天對(duì)照組 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000模型組 0.144±0.0551） 1.922±0.1751） 1.301±0.1321） 0.266±0.0432） 2.347±0.4111） 1.248±0.580治療組 0.461±0.0041）2） 2.796±0.4091）2） 1.434±0.1121）3） 0.526±0.0471）2） 2.569±0.2351）3） 1.329±0.096 F值 169.648 12.212 5.005 129.043 25.558 1.773 P值 0.000 0.001 0.023 0.000 0.000 0.206 P32組別

圖3 P32（A1～I(xiàn)1）和PKD1（A2～I(xiàn)2）在大鼠肺組織中的表達(dá) （DAB顯色，200μm）

圖4 各組不同時(shí)間點(diǎn)P32蛋白表達(dá)量變化

圖5 各組不同時(shí)間點(diǎn)PKD1蛋白表達(dá)量變化

各組在不同時(shí)間點(diǎn)的P32和PKD1 蛋白表達(dá)量比較，采用LSD-t法，結(jié)果顯示，第14天，2種細(xì)胞因子在模型組和治療組中的蛋白表達(dá)量均比對(duì)照組降低，治療組的蛋白表達(dá)均比模型組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。第21天，模型組和治療組中這2種細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組中這2種細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)量雖然高于模型組，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第28天，這2種細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)，治療組均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但是模型組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），治療組中這2種細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)量雖然略高于模型組，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表4）。2種細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的總體趨勢(shì)與mRNA表達(dá)情況基本一致。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，P32和PKD1的蛋白表達(dá)量之間具有相關(guān)性（r=0.859，P＜0.05）。

表4 P32和PKD1的蛋白表達(dá)情況 （平均光密度，n=10，±s）

表4 P32和PKD1的蛋白表達(dá)情況 （平均光密度，n=10，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與對(duì)照組比較，P＞0.05；3）與模型組比較，P＜0.05；4）與模型組比較，P＞0.05

P32組別PKD1第14天 第21天 第28天 第14天 第21天 第28天對(duì)照組 0.955±0.040 0.812±0.039 0.783±0.048 0.836±0.038 0.763±0.026 0.659±0.039模型組 0.591±0.0261） 1.086±0.0171） 0.824±0.0502） 0.493±0.0361） 1.087±0.0281） 0.722±0.0382）治療組 0.801±0.0441）3） 1.156±0.1311）4） 0.946±0.0231）4） 0.701±0.0341）3） 1.191±0.0791）4） 0.808±0.0221）4）

3 討論

HYP含量檢測(cè)是評(píng)價(jià)肺纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示各組肺組織HYP含量，在不同時(shí)間點(diǎn)模型組均高于對(duì)照組，且隨建模時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高；治療組均低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組。這說(shuō)明本研究選用氣管內(nèi)注射博來(lái)霉素的方法成功復(fù)制了大鼠肺纖維化模型，活性VD3對(duì)肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展有一定的緩解作用。

PKD1是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，PKD1被證實(shí)是一種線粒體氧化壓力感受器及抗氧化酶表達(dá)的調(diào)節(jié)器[10]。PKD1可以把線粒體中ROS水平升高的信號(hào)從線粒體傳遞到細(xì)胞核，誘導(dǎo)線粒體體內(nèi)MnSOD的表達(dá)以保護(hù)細(xì)胞器和細(xì)胞免受氧化應(yīng)激介導(dǎo)的損傷和細(xì)胞死亡[4，10-11]。有文獻(xiàn)報(bào)道[12]，PKD1 能被氧自由基調(diào)節(jié)，低濃度的氧化劑使酶活化，而高濃度的氧化劑則使酶滅活。本研究結(jié)果顯示，在纖維發(fā)生早期（第14天），模型組和治療組中PKD1細(xì)胞因子無(wú)論從轉(zhuǎn)錄水平還是從蛋白質(zhì)水平，其表達(dá)均比其在對(duì)照組中降低。這可能是在肺纖維化早期，博來(lái)霉素在體內(nèi)活化產(chǎn)生大量的活性氧，抑制了PKD1的表達(dá)。然而第14天治療組中2種細(xì)胞因子的表達(dá)量又高于模型組，說(shuō)明活性VD3能夠上調(diào)PKD1的表達(dá)，提高PKD1抗氧化的能力，保護(hù)線粒體免受活性氧的損害。

在第21天，模型組和治療組中PKD1的mRNA和蛋白表達(dá)均高于第14天的表達(dá)，這可能是隨著疾

病發(fā)展，活性氧水平下降，解除了對(duì)PKD1的抑制作用，導(dǎo)致PKD1被激活上調(diào)；治療組中PKD1的表達(dá)量雖然略高于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明活性VD3在第21天時(shí)對(duì)PKD1表達(dá)的上調(diào)作用并不明顯。第28天，模型組、治療組中PKD1的表達(dá)量與其相應(yīng)的第21天時(shí)的表達(dá)量相比，均降低，而治療組中的表達(dá)量雖然略高于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是28 d時(shí)氧化/抗氧化趨于平衡，線粒體氧化應(yīng)激減弱，PKD1介導(dǎo)的抗氧化作用減弱。提示線粒體氧化應(yīng)激及PKD1介導(dǎo)的抗氧化通路可能在大鼠肺纖維化前期（21天前）發(fā)揮重要作用?；钚訴D3在肺纖維化早期（21天前）能夠促進(jìn)PKD1及其介導(dǎo)的抗氧化通路相關(guān)分子的表達(dá)，具有一定的抗氧化作用。

P32蛋白是一個(gè)分子量為32KD的多功能酸性蛋白，以環(huán)形三聚體的形態(tài)主要存在于細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中[13]。P32蛋白可以與蛋白激酶C（PKC）的所有亞型相結(jié)合并增強(qiáng)PKC的活性，可能是PKC定位和功能的調(diào)節(jié)因子[7]。PKCδ為PKC家族的一個(gè)亞型，是PKD1的一種上游激酶，P32可以與PKCδ緊密結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控PKD1參與許多重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[14-15]。STORZ等[7]在B細(xì)胞系SKW6.4中證實(shí)了P32能夠與PKD1在線粒體膜上結(jié)合。本研究發(fā)現(xiàn)，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化過(guò)程中，P32 mRNA和蛋白的表達(dá)總體趨勢(shì)與PKD1相似。在第14天時(shí)，無(wú)論mRNA水平還是蛋白水平，治療組的表達(dá)量均高于模型組。第21天，mRNA水平治療組的表達(dá)量高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，蛋白水平治療組的表達(dá)量雖然高于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第28天，治療組和模型組之間mRNA和蛋白水平表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是mRNA還是蛋白水平，P32和PKD1的表達(dá)均具有相關(guān)性，且免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示兩者的表達(dá)分布一致，說(shuō)明P32可能與PKD1在線粒體內(nèi)結(jié)合，PKD1被線粒體氧化應(yīng)激激活，通過(guò)調(diào)節(jié)PKD1介導(dǎo)的線粒體-核抗氧化通路來(lái)緩解線粒體的氧化壓力。本研究表明活性VD3在早期（14天）可以增加P32和PKD1的表達(dá)量，說(shuō)明活性VD3可能在肺纖維化早期促進(jìn)P32和PKD1的表達(dá)，通過(guò)P32和PKD1相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)抗氧化作用，進(jìn)而影響肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

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