α7nAChR激動(dòng)劑對(duì)大鼠移植肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用*

趙正維，王海強(qiáng)，尹遜亮，張志培，李小飛，周勇安

（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 胸外科，陜西 西安 710038）

隨著器官移植領(lǐng)域的研究進(jìn)展和技術(shù)進(jìn)步，肺移植術(shù)后患者存活率及生活質(zhì)量得到巨大的改善，肺移植被認(rèn)為是治療終末期肺疾病的重要手段[1]。但是目前，肺移植術(shù)后仍會(huì)有諸多并發(fā)癥，其早期最為嚴(yán)重的并發(fā)癥便是移植肺的缺血再灌注損傷（ischemia and reperfusion，I/R），它是引起移植肺功能喪失和患者死亡的首要原因[2-3]。怎樣預(yù)防和減輕移植肺的I/R一直以來都是肺移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，I/R過程中的炎癥反應(yīng)可以有效地被α7nAChR激動(dòng)劑（PNU 282987）抑制[4]。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制同種異體大鼠左肺移植動(dòng)物模型，探討α7nAChR激動(dòng)劑對(duì)大鼠肺移植中I/R的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性近交系成年SD大鼠40只，體重200～250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。其中32只作為供受體，供、受體之間體重差不超過20 g。PNU 282987購自（美國）Tocris公司，腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6）試劑盒購自武漢博士得生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，所有大鼠術(shù)前禁食12 h，不禁水。A組為假手術(shù)組（8只）：該組大鼠僅行機(jī)械通氣和開胸手術(shù)，不行缺血和再灌注處理；B組為生理鹽水處理的I/R組（16只）：該組行左肺原位移植，移植成功后受體腹腔注射等量生理鹽水替代 PNU 282987。C組為PNU 282987處理組（16只）：該組大鼠同樣行左肺原位移植，移植成功后受體腹腔注射PNU 282987 2.4 mg/kg[5]。

1.2.2 移植模型 復(fù)制同種異體大鼠左肺原位移植模型，采用改良的三袖套法吻合技術(shù)建立同種異體大鼠左肺原位移植模型[6]。

1.2.3 血?dú)夥治?移植成功后開放血流再灌注4 h，阻斷右肺門5 min，抽頸動(dòng)脈血做血?dú)夥治觥?/p>

1.2.4 移植肺W/D測(cè)定 取上1/3肺組織稱重，分析天平稱取濕重（W）；隨后置入60℃烤箱中，72 h后重量不再變化時(shí)稱取干重（D），計(jì)算W/D。

1.2.5 移植肺組織TNF-α及IL-6含量測(cè)定 移植肺在冷生理鹽水內(nèi)漂洗、濾紙吸干黏液，以冷生理鹽水作為勻漿介質(zhì)，冰浴下以玻璃勻漿器勻漿，4℃，3 500 r/min轉(zhuǎn)低溫離心15 min取上清。采用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組TNF-α及IL-6的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植肺PaO2、PaCO2及W/D比較

與A組比較，B組PaO2下降、PaCO2升高，肺組織W/D值升高；與B組比較，C組的PaO2升高、肺組織W/D值下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 移植肺組織TNF-α及IL-6含量比較

與A組比較，B組移植肺TNF-α及IL-6含量升高；與B組比較，C組移植肺TNF-α及IL-6含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠肺組織的病理學(xué)變化

A組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出。B組可見肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞明顯，有明顯的炎細(xì)胞浸潤。C組可見炎細(xì)胞浸潤明顯，但與B組比較，肺泡結(jié)構(gòu)依舊比較完整。見附圖。

表1 移植肺PaO2、PaCO2及W/D比較 （±s）

表1 移植肺PaO2、PaCO2及W/D比較 （±s）

注：1）與A組比較，P＜0.05；2）與B組比較，P＜0.05

組別 PaO2/mmHg PaCO2/mmHg W/D A 組 105.75±12.09 15.75±4.62 4.08±1.06 B組 74.25±11.841） 27.00±4.041） 6.98±1.261）C組 91.38±10.502） 22.75±2.672） 5.14±1.302）F值 15.050 17.290 11.742 P值 0.000 0.000 0.000

表2 移植肺TNF-α及IL-6含量比較 （μg/L，±s）

表2 移植肺TNF-α及IL-6含量比較 （μg/L，±s）

注：1）與A組比較，P＜0.05；2）與B組比較，P＜0.05

組別 TNF-α IL-6 A組 98.38±13.04 60.38±14.54 B組 150.25±24.421） 98.63±15.031）C組 126.75±14.772） 77.75±17.522）F值 16.445 11.828 P值 0.000 0.000

附圖 各組大鼠肺組織的病理學(xué)變化 （HE ×200）

3 討論

作為治療終末期肺疾病的重要手段，雖然現(xiàn)在供肺的保存與轉(zhuǎn)運(yùn)手段取得了巨大進(jìn)步，同時(shí)，肺移植的手術(shù)技巧和術(shù)后管理水平也得到了不斷提高，但是I/R損傷仍然是肺移植術(shù)后難以完美解決的難題，I/R損傷可導(dǎo)致原發(fā)性移植肺的功能障礙，同時(shí)會(huì)帶來諸多并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致移植肺喪失功能及患者死亡[3]。因此，預(yù)防和減輕I/R損傷是肺移植領(lǐng)域十分重要的研究內(nèi)容。研究顯示，肺移植術(shù)后的I/R損傷是眾多細(xì)胞因子參與的炎癥損傷過程。I/R過程激活移植肺組織內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，釋放一系列細(xì)胞因子，其中TNF-α及IL-6水平增高，其促進(jìn)白細(xì)胞的趨化、浸潤、聚集、活化和炎癥鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)生，參與了受體內(nèi)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等白細(xì)胞的游走和活化，攻擊損傷血管內(nèi)皮，引起器官組織再灌注損傷的病理生理改變。

另外有研究表明，在人體內(nèi)存在一條抗炎通路即膽堿能抗炎通路（cholinergic anti inflammatory pathway，CAP），它是通過迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)乙酰膽堿與免疫系統(tǒng)之間的相互作用來參與抗炎作用，是一條神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)通路[7]。

α7nAChR就在該通路中起重要作用，它屬于煙堿型乙酰膽堿受體，是由5個(gè)α7單體組成的配體門控離子通道，廣泛分布于神經(jīng)、呼吸、循環(huán)、免疫、生殖系統(tǒng)中，對(duì)鈣離子有良好的通透性，其參與的病理生理過程都涉及鈣離子的內(nèi)流。已有研究發(fā)現(xiàn)，激活α7nAChR后可以發(fā)揮抗炎、抗凋亡、抗氧化、促血管生成等4大作用[8-10]。因此α7nAChR是膽堿能性抗炎通路與炎癥反應(yīng)之間的關(guān)鍵。迷走神經(jīng)受到刺激后終末傳出支釋放乙酰膽堿，特異性結(jié)合于組織巨噬細(xì)胞表面的a7nAChR，抑制炎癥細(xì)胞因子釋放，從而發(fā)揮控制炎癥反應(yīng)的作用[11-12]。因此，猜測(cè)激活a7nAChR可以間接降低肺移植后I/R中TNF-α及IL-6的含量，進(jìn)而發(fā)揮其快速的抗炎作用。

本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制同種異體大鼠左肺移植I/R損傷的動(dòng)物模型，探討α7nAChR激動(dòng)劑對(duì)大鼠移植肺I/R損傷是否具有保護(hù)作用及可能機(jī)制。通過合理的空白對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)α7nAChR激動(dòng)劑處理組中的PaO2升高、肺組織W/D值下降同時(shí)TNF-α及IL-6的含量降低，其可能的作用機(jī)制為α7nAChR激動(dòng)劑可以通過CAP途徑降低肺移植后體內(nèi)TNF-α及IL-6的含量，從而抑制I/R過程中炎癥介質(zhì)的釋放，炎癥介質(zhì)的減少能夠減輕術(shù)后大鼠的肺水腫，降低W/D值，進(jìn)而改善移植肺的肺功能。這一結(jié)果提示α7nAChR激動(dòng)劑在預(yù)防肺移植術(shù)后的I/R損傷中具有一定的使用價(jià)值。

[1]許志揚(yáng),許建新,康明強(qiáng).NF-κB抑制劑對(duì)大鼠移植肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2014,25: 11-15.

[2]姜達(dá)志,趙金龍,錢永躍.肺缺血再灌注損傷機(jī)制研究進(jìn)展[J].國際呼吸雜志,2013,33(12): 941-944.

[3]ALTUN G T,ARSLANTAS M K.CINEL I.Primary graft dysfunction after lung transplantation[J].Turk J Anaesthesiol Reanim,2015,43(6): 418-423.

[4]朱國松,羅剛健,葉志強(qiáng),等.α7nAChR激動(dòng)劑和烏司他丁對(duì)大鼠腸缺血再灌注后肺組織IL-1β、IL-6和TNF-α作用的比較[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2013,29(8): 1231-1233.

[5]熊軍,薛富善,袁玉靜,等.α7nAChR激動(dòng)劑-缺血后處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志,2010,30(9): 1118-1121.

[6]林江波,陳道中,康明強(qiáng),等.袖套法建立大鼠肺移植模型的手術(shù)技巧.中國組織工程研究與臨床康復(fù)[J].2010,14(44): 8186-8190.

[7]項(xiàng)輝,胡波,李建國.對(duì)膽堿能抗炎通路研究的新認(rèn)識(shí)[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2012,24(3): 185-188.

[8]LI D J,HUANG F,NI M,et al.Alpha7 nicotinic acetylcholine receptor relieves angiotensin ii-induced senescence in vascular smooth muscle cells by raising nicotinamide adenine dinucleotidedependent SIRT1 activity[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2016 36(8): 1566.

[9]TILLMAN T S,ALVAREZ F J,REINERT N J,et al.Functional human alpha7 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) generated from E.coli[J].J Biol Chem,2016,291(35): 18276.

[10]ZANETTI S R,ZIBLAT A,TORRES N I,et al.Expression and functional role of alpha7 nicotinic receptor in human cytokinestimulated NK cells[J].J Biol Chem,2016 291(35): 16542-16552.

[11]INOUE T,ABE C,SUNG S S,et al.Vagus nerve stimulation mediates protection from kidney ischemia-reperfusion injury through a7nAChR+ splenocytes[J].J Clin Invest,2016,126(5):1939-1952.

[12]GONG Y,JIANG J H,LI S T.Functional expression of human alpha7 nicotinic acetylcholine receptor in human embryonic kidney 293 cells[J].Mol Med Rep,2016,14(3): DOI: 10.3892/mmr.2016.5493.