X線照射、順鉑及X線照射+順鉑對(duì)CC趨化因子受體7表達(dá)的影響

， ，，，，，，

(1.福建省腫瘤醫(yī)院、福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，福建 福州 350014；2. 福建省腫瘤醫(yī)院、福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放射生物研究室，福建 福州 350014；3. 福建省人民醫(yī)院放射科，福建 福州 350004；4.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院放療科，福建 廈門 361000)

惡性腫瘤是危及人類生命的常見(jiàn)原因之一，最近研究表明，趨化因子受體及其配體在腫瘤細(xì)胞的特異、定向轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[1-3]。目前已發(fā)現(xiàn)約50種趨化因子及20余種趨化因子受體[4]。趨化因子受體及其配體在眾多腫瘤中表達(dá)明顯增加[5]。在本研究主要分析CC趨化因子受體7(CCR7)在大腸癌SW480細(xì)胞、肺癌SPC-A1細(xì)胞、鼻咽癌CNE-2細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)觀察不同X線照射劑量和方案、不同的順鉑濃度及同步X線照射+順鉑作用后CCR7表達(dá)的變化，從而為明確腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制和控制腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供進(jìn)一步的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株將大腸癌SW480細(xì)胞、肺癌SPC-A1細(xì)胞、鼻咽癌CNE-2細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，常規(guī)傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2照射方法及順鉑配制采用6 MV-X線照射，劑量率350 cGy·min-1，照射野大?。?0 cm×40 cm，源皮距100 cm；根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將順鉑用RPMI-1640培養(yǎng)基配制成實(shí)驗(yàn)濃度。

1.3實(shí)驗(yàn)分組方案單次照射SW480細(xì)胞、SPC-A1細(xì)胞及CNE-2細(xì)胞0 Gy、2 Gy、10 Gy、20 Gy 6 MV-X線24 h、48 h后觀察其CCR7表達(dá)變化:1)比較單次不同劑量X線照射后不同時(shí)間CCR7的表達(dá)：?jiǎn)未? Gy、2 Gy、10 Gy和20 Gy X線照射SW480細(xì)胞、SPC-A1細(xì)胞和CNE-2細(xì)胞24 h、48 h后，檢測(cè)CCR7的表達(dá)；2)不同X線照射方案對(duì)SPC-A1細(xì)胞CCR7表達(dá)影響： 8 Gy單次X線照射與2 Gy·d-1連續(xù)照射6 d這2種方案作用于SPC-A1細(xì)胞后24 h和48 h，比較觀察CCR7表達(dá)的變化；3)比較不同濃度順鉑不同作用時(shí)間后CNE-2細(xì)胞CCR7表達(dá)變化：將CNE2細(xì)胞培養(yǎng)于含0 μg·mL-1、0.032 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1、20 μg·mL-1順鉑培養(yǎng)基中24 h、48 h后，比較觀察CCR7表達(dá)的變化；4)觀察X線照射、順鉑及X線照射+順鉑對(duì)CNE-2細(xì)胞CCR7表達(dá)的影響：?jiǎn)渭? Gy·d-1連續(xù)照射6 d，0 μg·mL-1、0.032 μg·mL-1、0.8μg·mL-1、20 μg·mL-1順鉑，2 Gy·d-1連續(xù)照射6 d+0 μg·mL-1、0.032 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1或20 μg·mL-1順鉑這些方案作用CNE-2細(xì)胞48 h后，比較觀察分CCR7表達(dá)的變化。

1.4采用Westernblot法檢測(cè)各細(xì)胞CCR7表達(dá)收集各處理因素作用后的細(xì)胞，通過(guò)Micro-BCA試劑盒法將蛋白含量調(diào)成等濃度，并在100 ℃沸水中煮5 min使其變性，將等量的蛋白加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后的蛋白被轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙稀膜上，加入約50 μL的CCR7一抗多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，1150)3 h后，用15 000的二抗孵育1 h，曝光后洗片，將膠片置于白光下進(jìn)行分析、掃描，使用Quantity one軟件分析各條帶。

2 結(jié)果

2.1不同劑量X線單次照射不同時(shí)間后SW480細(xì)胞、SPC-A1細(xì)胞及CNE-2細(xì)胞CCR7表達(dá)的變化3)SW480細(xì)胞：2 Gy和10 Gy X線照射24 h后，SW480細(xì)胞中CCR7的表達(dá)高于0 Gy組，且隨照射劑量的增加而增加(P均<0.05)；與10 Gy組比較，20 Gy組的CCR7表達(dá)沒(méi)有進(jìn)一步增加(P>0.05)。照射48 h后，各劑量組CCR7的表達(dá)較0 Gy組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；但2 Gy、10 Gy、20 Gy組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。0 Gy組、2 Gy組CCR7的表達(dá)48 h較24 h增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，而10 Gy組、20 Gy組48 h與24 h比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 不同劑量X線單次照射

2)SPC-A1細(xì)胞：0 Gy、2 Gy、10 Gy、20 Gy X線照射SPC-A1細(xì)胞24 h后各組SPC-A1細(xì)胞CCR7表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。0 Gy、2 Gy、10 Gy、20 Gy X線照射SPC-A1細(xì)胞48 h后各組SPC-A1細(xì)胞CCR7表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。各劑量組照射24 h、48 h后SPC-A1細(xì)胞CCR7表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同劑量X線單次照射

3)CNE-2細(xì)胞：照射24 h后，各劑量組CCR7的表達(dá)較0 Gy組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；但2 Gy、10 Gy、20 Gy組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。照射48 h后，各劑量組CCR7的表達(dá)較0 Gy組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；但2 Gy、10 Gy、20 Gy組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。各劑量組照射48 h后CCR7表達(dá)均較照射24 h后明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 不同劑量X線單次照射

2.22種X線照射模式對(duì)SPC-A1細(xì)胞CCR7表達(dá)的影響8 Gy單次X線照射組與2 Gy·d-1連續(xù)照射6 d組(生物學(xué)效應(yīng)等效于8 Gy單次照射組)24 h的CCR7比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；8 Gy單次X線照射組與2 Gy·d-1連續(xù)照射6 d組(生物學(xué)效益等效于8 Gy單次照射組)48 h的CCR7比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各劑量組24 h、48 h的CCR7比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 2種X線照射模式對(duì)SPC-A1細(xì)胞CCR7表達(dá)的影響

2.3不同濃度順鉑作用于CNE-2細(xì)胞不同時(shí)間后CCR7表達(dá)的變化不同濃度順鉑作用24 h后，與0 μg·mL-1順鉑組比較，0.032 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達(dá)無(wú)變化(P>0.05)，而0.8 μg·mL-1順鉑組、20 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；0.8 μg·mL-1順鉑組、20 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達(dá)明顯高于0.032 μg·mL-1順鉑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)； 20 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達(dá)明顯高于0.8 μg·mL-1順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

不同濃度順鉑作用48 h后，與0 μg·mL-1順鉑組比較，0.032 μg·mL-1順鉑組、0.8 μg·mL-1順鉑組、20 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；0.8 μg·mL-1順鉑組、20 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達(dá)明顯高于0.032 μg·mL-1順鉑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；20 μg·mL-1順鉑組CCR7的表達(dá)明顯高于0.8 μg·mL-1順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

0 μg·mL-1順鉑組、0.032 μg·mL-1順鉑組及0.8 μg·mL-1順鉑組CCR7表達(dá)48 h較24 h降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。20 μg·mL-1順鉑組CCR7表達(dá)48 h與24 h比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 不同濃度順鉑作用于

2.4X線照射、順鉑及同步X線照射+順鉑對(duì)CNE2細(xì)胞CCR7表達(dá)的影響與2 Gy·d-1連續(xù)照射6 d組及0.032 μg·mL-1順鉑組比較，0.032 μg·mL-1順鉑+2 Gy組CCR7的表達(dá)無(wú)明顯變化(P均>0.05)。與2 Gy·d-1連續(xù)照射6 d組及0.8 μg·mL-1順鉑組比較，0.8 μg·mL-1順鉑+2 Gy組CCR7的表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。與2 Gy·d-1連續(xù)照射6 d組及20 μg·mL-1順鉑組比較，20 μg·mL-1順鉑+2 Gy組CCR7的表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。0.032 μg·mL-1順鉑+2 Gy組、0.8 μg·mL-1順鉑組+2 Gy組、20 μg·mL-1順鉑+2 Gy組3組CCR7的表達(dá)兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 X線照射、順鉑及同步X線

3 討論

趨化因子受體是一種G-偶聯(lián)蛋白，其在許多類型的細(xì)胞上表達(dá)，已發(fā)現(xiàn)超過(guò)50種人類趨化因子[6]。趨化因子受體與其相應(yīng)配體結(jié)合參與多種各種生理和病理過(guò)程[7]。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，在引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移至特定的淋巴結(jié)和器官過(guò)程中，趨化因子及其受體組成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮重要作用。CCR7/CCL21軸主要引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[2,10,11-16]。

趨化因子受體參與惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。然而，一些文獻(xiàn)[17-20]報(bào)道，受到亞致死性X線照射時(shí)，惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力可能增加。1949年，Kaplan等[21]首先報(bào)道放療可能增加患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移機(jī)率，1970年Suit等[22]也發(fā)現(xiàn)，原發(fā)部位復(fù)發(fā)腫瘤患者接受治療后轉(zhuǎn)移率較高。本文主要探討X線照射與SW480細(xì)胞、SPC-A1細(xì)胞、CNE-2細(xì)胞CCR7表達(dá)的關(guān)系及X線照射、順鉑及同步X線照射+順鉑對(duì)CNE-2細(xì)胞CCR7表達(dá)的影響。

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤，其常見(jiàn)轉(zhuǎn)移途徑是淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，在某些器官和組織中其趨化因子及其受體的表達(dá)特異性增加。從免疫組化圖上(SW480細(xì)胞)可以看出，趨化因子受體在細(xì)胞漿內(nèi)少量表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞膜上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(如圖2)，在照射劑量等于或小于10 Gy時(shí)，照射24小時(shí)后，隨著照射劑量的增加，CCR7的表達(dá)增加；20 Gy組中CCR7的表達(dá)與10 Gy組比較沒(méi)有進(jìn)一步增加; 48 h后，2 Gy，10 Gy和20 Gy組與對(duì)照組相比有所增加，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大腸癌SW480細(xì)胞CCR7的表達(dá)在單劑量小于或等于10 Gy的X射線下增加，但在20 Gy的單劑量下增加的趨勢(shì)不再明顯，這可能與單次大劑量X射線照射對(duì)細(xì)胞殺傷效應(yīng)及CCR7基因損傷有關(guān)。CCR7與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，X射線照射增加了CCR7的表達(dá)，因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示放療可提高腫瘤的局部控制率，但在低劑量放療時(shí)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而高劑量放療時(shí)盡管CCR7表達(dá)增加，由于射線殺傷作用提高，其轉(zhuǎn)移能力并不一定增強(qiáng)。

肺癌是目前危及人類生命的最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，用各種治療方案提高肺癌控制率勢(shì)在必行。本研究表明，CCR7在SPC-A1細(xì)胞中的表達(dá)不隨照射時(shí)間和劑量而改變，大劑量照射較常規(guī)照射CCR7表達(dá)無(wú)變化，提示SPC-A1細(xì)胞中CCR7對(duì)X線無(wú)應(yīng)答。因此在放、化療過(guò)程中給予相應(yīng)的CCR7阻斷劑可進(jìn)一步減少肺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而提高治療效果。

鼻咽癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，綜合治療失敗的主要原因仍為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[23]。順鉑是頭頸部腫瘤最常用化療藥物之一，本研究探討CNE-2細(xì)胞CCR7在X線照射、順鉑及同步X線照射+順鉑作用后表達(dá)的變化，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CNE-2細(xì)胞在X線照射后CCR7的表達(dá)增加，但其表達(dá)水平并未隨劑量的增加而改變。因此，低劑量照射可能使CNE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增加，增加放療劑量盡管使CCR7增加，但由于X線的殺傷作用，并不一定增強(qiáng)其抑制轉(zhuǎn)移能力。CNE-2細(xì)胞CCR7的表達(dá)在X線照射、順鉑及同步X線照射+順鉑處理后表達(dá)增加，相比單純順鉑，同步X線照射+順鉑作用后CCR7的表達(dá)下降，而相比X線照射變化不明顯。因此，我們可以看出，與單純化療比較，同步放、化療可能降低CNE-2細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，這與臨床研究一致，即同時(shí)放、化療可以減少鼻咽癌轉(zhuǎn)移并提高生存率[24-28]。

本實(shí)驗(yàn)僅在蛋白水平了解不同細(xì)胞各因素處理后CCR7表達(dá)的變化，仍不明確腫瘤細(xì)胞真正轉(zhuǎn)移能力，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)在體外進(jìn)行，X線照射、順鉑、同步X線照射+順鉑對(duì)動(dòng)物CCR7表達(dá)和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響尚不清楚，因此，有必要通過(guò)趨化小室，進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn)，由于多種分子均涉及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，因此需進(jìn)一步研究上述研究因素對(duì)其他涉及腫瘤轉(zhuǎn)移因素的影響。同時(shí)，多種干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞均表達(dá)趨化因子受體，拮抗趨化因子受體的靶向療法可能引起多種臨床不良反應(yīng)，因此需進(jìn)一步研究如何針對(duì)趨化因子受體的拮抗治療。