腎癌組織中卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白62的HLA-A2表位肽的篩選和鑒定

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(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001)

腎癌在全球惡性腫瘤之中占3%,發(fā)病率和病死率均較高[1]。而且,腎癌對(duì)于化療和放療的治療效果都不太理想，并且尚未發(fā)現(xiàn)十分有效的輔助治療方法。細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)是淋巴細(xì)胞的一種，這種淋巴細(xì)胞就是專門的CD8+T細(xì)胞,這種特定類型的免疫淋巴細(xì)胞可以消滅另一種特定的細(xì)胞。CTL在與腫瘤研究相關(guān)的領(lǐng)域里面發(fā)揮著獨(dú)特的意義。能消滅另一種特定細(xì)胞的關(guān)鍵就在一種特殊的復(fù)合物。這種復(fù)合物的特點(diǎn)就是抗原肽和目的腫瘤細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ合在一起，從而才能被CD8+T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)進(jìn)而發(fā)生消滅腫瘤細(xì)胞的行為。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白62(coiled-coil domain containing patients 62， CCDC62)是一種腫瘤-睪丸抗原。正常的機(jī)體組織中，僅能在睪丸組織中檢測(cè)到CCDC62的mRNA表達(dá)，但在結(jié)直腸癌、胃癌、頭頸癌、腎癌等腫瘤組織中也有一定的表達(dá)[2]。目前，用于治療各種腫瘤的肽疫苗正處于臨床研究的活躍階段?？乖男枰槍?duì)特定的人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)分型進(jìn)行預(yù)測(cè)。在我國(guó)人群中，HLA-A2的分型占到了45%左右。因此，針對(duì)HLA-A2的表型預(yù)測(cè)有著很重要的意義[3]。本研究通過NetCTL1.2軟件進(jìn)行生物信息學(xué)綜合預(yù)測(cè)，篩選出得分較高的抗原表位，并進(jìn)一步進(jìn)行CCDC62表位肽表位的篩選和鑒定。

1 材料與方法

1.1材料T2A2細(xì)胞由鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，采用體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)。外周血單個(gè)核細(xì)胞采集自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的腎癌患者，所有病例均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。該研究已經(jīng)獲得了鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2方法

1.2.1 HLA-A2分型表位肽的預(yù)測(cè) 用NetCTL 1.2網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk /services /NetCTL/)對(duì)目的癌睪抗原CCDC62進(jìn)行序列的預(yù)測(cè)和分?jǐn)?shù)評(píng)定。根據(jù)分?jǐn)?shù)情況，選擇得分大于1.0的表位肽進(jìn)行合成。

1.2.2 HLA-A2限制性CTL表位肽的合成和鑒定 課題組根據(jù)得分選定的表位肽委托鄭州派和泰德醫(yī)藥科技有限公司來(lái)進(jìn)行制作合成，并且通過進(jìn)行高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)的分析與純化步驟之后，這些肽的純度>95%。并且通過HPLC檢測(cè)之后，這些抗原肽的相對(duì)分子質(zhì)量與理論值相符合，可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 HLA-A2分子與合成后的表位肽進(jìn)行結(jié)合力實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)T2A2細(xì)胞至生長(zhǎng)旺盛的時(shí)期，用伊思柯夫改良培養(yǎng)基 (Iscove’s modified Dubecco’s medium，IMDM)洗滌3遍，細(xì)胞密度調(diào)為 2 ×106·L-1，加入48孔板。每孔加入肽和β2-微球蛋白的量為25 μg、0.25 μg。在體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)18 h以后，使用預(yù)冷的PBA溶液再次洗滌3遍，每個(gè)樣品加入0.5 μL的抗人HLA-A2抗體。在4 ℃冰箱里面不被光照的條件下經(jīng)過30 min，用PBA溶液洗滌再上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果用熒光系數(shù)(flourescence index，F(xiàn)I)表示。FI=(表位肽平均熒光強(qiáng)度-背景平均熒光強(qiáng)度)/背景平均熒光強(qiáng)度。高等結(jié)合是FI>1.0，中等結(jié)合是FI為0.5～1.0之間，低結(jié)合是FI<0.5[4]。

1.2.4 CTL的誘導(dǎo) 對(duì)來(lái)自腎癌患者的20 mL外周血進(jìn)行分類，加入抗體后經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選檢測(cè)，結(jié)果證明為HLA-A2陽(yáng)性后。配制含有淋巴細(xì)胞分離液的混合溶液然后通過密度梯度離心的方法，收集培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞。培養(yǎng)基是含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基，在24孔板中培育時(shí)的細(xì)胞濃度調(diào)為2×106·L-1。第1天后每孔加入肽50 mg·L-1、β2-微球蛋白0.5 mg·L-1。第3天，加30 u·mL-1的重組人白介素-2,間隔1 d加重組人白介素-2，刺激周期1周。第2輪的誘導(dǎo)從第8天開始，重復(fù)第1輪的操作，但是要在第3天加入CD3刺激性抗體。刺激3輪后，培養(yǎng)至21 d，收集細(xì)胞。經(jīng)過以上過程的細(xì)胞就是效應(yīng)細(xì)胞，即CTL。實(shí)驗(yàn)中需要的靶細(xì)胞是荷肽的T2A2細(xì)胞，用無(wú)血清的IMDM培養(yǎng)基來(lái)調(diào)細(xì)胞密度。

1.3數(shù)據(jù)分析流式細(xì)胞儀得出的數(shù)據(jù)結(jié)果用FlowJo軟件進(jìn)行分析，并用GraphPad Prism軟件制圖和分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1CCDC62的HLA-A2限制性表位的預(yù)測(cè)結(jié)果依據(jù)NetCTL1.2軟件的結(jié)果，選擇得分>1.0的表位肽。見表1。

表1 CCDC62的HLA-A2限制性表位預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2表位肽與HLA-A2分子結(jié)合力實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果表明CCDC62-P137和CCDC62-P141這2條肽都有較好結(jié)合力(FI>1.0)。見表2。

表2 候選肽與HLA-A2分子的結(jié)合力結(jié)果

2.3細(xì)胞內(nèi)因子染色實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)T細(xì)胞釋放IFN-γ的水平細(xì)胞內(nèi)因子染色檢測(cè)表位肽誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的比例。負(fù)載抗原肽(50 mg·L-1)的T2A2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞來(lái)自抗原肽(10 mg·L-1)體外誘導(dǎo)的腎癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞。以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代作為本實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照組，HBcAg18-27替代作為本實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照組。表位肽P137相對(duì)于對(duì)照組能激發(fā)產(chǎn)生更多的IFNγ+CD8+T細(xì)胞。見圖1。

3 討論

腎癌這種腫瘤疾病對(duì)廣泛用于其他腫瘤疾病的放療和化療的效果都沒有較好的反饋。如今，分子免疫學(xué)和生物信息學(xué)在不斷發(fā)展，為我們通過免疫治療方法治療惡性腫瘤提供了支持和保障。目前，腫瘤的免疫治療是腫瘤的研究熱點(diǎn)和前沿方向[7-8]。

圖1 腎癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過CCDC62

腫瘤疫苗的研究為腫瘤的治療和預(yù)防提供了新的思路和方法，并且近幾年有著極大的進(jìn)步與發(fā)展[9]。腫瘤疫苗的原理是用患者本體的免疫細(xì)胞來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，與放療和化療比較，有著極大的優(yōu)勢(shì)，且治療方案所導(dǎo)致的不良事件明顯減少，且癥狀也減輕[10]。腫瘤細(xì)胞的表面有多種抗原肽，這些抗原肽可以特異性激發(fā)免疫細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)[11]。

使用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)腫瘤的抗原表位，可以更加有針對(duì)性，且能夠縮短實(shí)驗(yàn)周期，提高實(shí)驗(yàn)效率。NetCTL 1.2既有MHC分子根據(jù)位點(diǎn)結(jié)合多肽的原理，并有CTL表位和其源蛋白組成的數(shù)據(jù)集，因此有較高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性[12]。

在本次研究中，使用腎癌患者的外周血，簡(jiǎn)化了體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)2次驗(yàn)證的步驟，同時(shí)也縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并且所采取的方案和所得結(jié)果具有更高的參考價(jià)值[13]。本課題組后期的工作就是進(jìn)一步拓展研究的范圍，一方面查找新的抗原，合成驗(yàn)證新肽的活性；另一方面，對(duì)現(xiàn)有的表位肽進(jìn)行改造加工，增強(qiáng)其活性。并且本課題組將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行表位肽活性的驗(yàn)證。