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      ICP-MS測定全血中5種微量元素及其參考區(qū)間的建立

      2018-03-07 05:47:06徐鳳仙于嘉屏吳娟娟
      檢驗醫(yī)學(xué) 2018年2期
      關(guān)鍵詞:安捷倫種元素稀釋液

      徐鳳仙, 于嘉屏, 吳娟娟

      (上海迪安醫(yī)學(xué)檢驗所研發(fā)實驗室,上海 200433)

      人體內(nèi)的微量元素含量處于動態(tài)平衡中,缺乏和過量都會對人體產(chǎn)生不良影響。人體鐵(iron,F(xiàn)e)、鎂(magnesium,Mg)、鈣(calcium,Ca)、鋅(zinc,Zn)、銅(copper,Cu)元素水平的高低與很多疾病及健康息息相關(guān),如精神分裂[1]、動脈粥樣硬化[2]、阿茲海默癥[3]、早產(chǎn)風(fēng)險[4-5]、新生兒健康[6-7]、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)[8]、慢性疾病[9]、抗氧化保護(hù)[10]等。如何快速、準(zhǔn)確地檢測人體微量元素水平,進(jìn)而推斷與疾病的相關(guān)性成為臨床亟待解決的問題。目前,檢測微量元素的方法有原子吸收光譜法(atomic absorption spectroscopy,AAS)[11]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry,ICP-AES)[12]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)[13]等。其中ICP-MS以其線性范圍寬、檢測敏感性高、可同時測定多種元素、基質(zhì)效應(yīng)低等特點受到普遍關(guān)注。我們擬建立ICP-MS同時檢測全血中Fe、Mg、Ca、Zn、Cu 5種元素的方法,探討ICP-MS用于臨床大樣本檢測的可行性。

      1 材料和方法

      1.1 儀器和試劑

      安捷倫7700x電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國安捷倫科技有限公司)、BY-400C型醫(yī)用離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)、BSA224SCW型分析天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、優(yōu)普超純水儀(成都超純科技有限公司)、快速混勻器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)、Thermo Scientific可調(diào)移液器(美國Thermo公司)等。硝酸(超純級,蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司)、Triton 100(美國西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司)。Fe、Mg、Ca、Zn、Cu標(biāo)準(zhǔn)品(可溯源至中國計量科學(xué)研究院)及內(nèi)標(biāo)品鍺(germanium,Ge)由國家有色金屬及電子材料分析檢測中心提供,濃度均為1 000 μg/mL。1 μg/L調(diào)諧液(鈰、鈷、鋰、Mg、鉈、釔混合液,美國安捷倫科技有限公司)

      1.2 方法

      1.2.1 儀器準(zhǔn)備 儀器按正常程序開機,抽真空,然后在待機情況下進(jìn)行儀器維護(hù),點火調(diào)諧,性能驗證成功后進(jìn)行批處理調(diào)諧。相關(guān)工作參數(shù):載氣流速為0.35 L/min,氣流速為0.61 L/min; 等離子體模式,高基質(zhì)系統(tǒng);等離子體氣流速為15 L/min;采樣深度為10 mm;射頻功率為1 550 W;提取透鏡為-200 V;Omega透鏡電壓為11.0 V;Omega偏轉(zhuǎn)電壓為-70 V;積分時間為0.1 s;重復(fù)次數(shù)為3次;蠕動泵流速為0.1 r/min;氦氣流速為5 L/min。在批處理調(diào)諧相關(guān)參數(shù)達(dá)到分析要求[質(zhì)量軸±0.1、每秒計數(shù)值(counts per second,CPS)>2 400、氧化物<1%,雙電荷<3%]后開始正常分析程序。

      1.2.2 采樣前相關(guān)試劑及系統(tǒng)準(zhǔn)備 進(jìn)樣分析前分別對系統(tǒng)中可能引起污染的部件,如霧化器、霧化池、炬管及錐進(jìn)行浸泡清洗,更換管線,每個樣本采集結(jié)束后分別切換至進(jìn)樣口沖洗、稀硝酸溶液及超純水清洗,相關(guān)試劑均用超純水稀釋至對應(yīng)濃度后進(jìn)樣檢測,考察各個元素的干擾情況。每個批次分析前分別進(jìn)樣超純水及稀釋液,排除空白干擾之后再進(jìn)行樣本分析。

      1.2.3 稀釋液配制 分別移取2.5 mL硝酸及0.5 mL Triton 100至500 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度,然后轉(zhuǎn)移至聚丙稀瓶中,得到含0.5%硝酸、0.1%Triton 100的稀釋液,儲存于4 ℃冰箱中待用。

      1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液配制 分別移取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品母液,參照全血樣本中不同目標(biāo)元素水平進(jìn)行配制,分別得到混合標(biāo)準(zhǔn)品母液,其中Fe、Mg、Ca、Zn、Cu水平分別為500、50、125、12.5、3.125 μg/mL。同樣移取適量內(nèi)標(biāo)品配制得到0.5 μg/mL 內(nèi)標(biāo)液,然后分別移取2.5、5、10、20、40 μL母液,加入20 μL內(nèi)標(biāo)液,然后分別定容至1 mL,得到S1、S2、S3、S4、S5 5個濃度,待用。

      1.2.5 樣本稀釋準(zhǔn)備 將全血樣本充分混勻,然后準(zhǔn)確移取20 μL全血樣本,加入20 μL內(nèi)標(biāo)液,再加入960 μL含0.5%硝酸、0.1%Triton 100的稀釋液,定容至1 mL,充分混勻,采用蠕動泵連續(xù)進(jìn)樣,采集時間為0.1 s。

      1.3 方法學(xué)評價

      1.3.1 線性評價 將混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液S1~S5按正常程序進(jìn)行處理并進(jìn)樣分析,觀察Fe、Mg、Ca、Zn、Cu 5種元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性。

      1.3.2 基質(zhì)效應(yīng)及相關(guān)干擾 分別準(zhǔn)備2個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品(C1),C1為理論濃度,進(jìn)樣分析得到一個檢測值C2。將同樣水平的標(biāo)準(zhǔn)品加入全血樣本中,檢測得到加入量C3,分別進(jìn)樣。平行檢測6份樣本,計算C1、C2與C3的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,即目標(biāo)元素在純稀釋液中與在全血基質(zhì)中結(jié)果的差異,評價基質(zhì)干擾程度。每批標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液檢測結(jié)束之后進(jìn)樣分析空白稀釋液,如果采集記數(shù)超過最低點計數(shù)的20%則繼續(xù)進(jìn)行空白稀釋液分析,直至殘留干擾達(dá)到S1點的20%以內(nèi)。

      1.3.3 精密度 分別準(zhǔn)備低、中、高水平混合全血樣本,進(jìn)行6次重復(fù)處理后進(jìn)樣分析,檢測5種元素的水平,觀察批內(nèi)重復(fù)性[以變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)表示];準(zhǔn)備低、中、高水平全血樣本,分3批進(jìn)行6次重復(fù)處理(分3 d,每天2批),進(jìn)樣分析,檢測5種元素的水平,觀察批間重復(fù)性(以CV表示)。

      1.3.4 添加回收試驗 將1份混合全血樣本平行測定20次,求得本底值L1,在此基礎(chǔ)上添加中水平和高水平標(biāo)準(zhǔn)品得到L2和L3,然后分別檢測L2和L3各元素的水平及對應(yīng)的添加回收率。

      1.3.5 室間比對試驗 分別準(zhǔn)備3個不同水平的全血樣本(C1、C2、C3),每個水平進(jìn)行6次進(jìn)樣檢測,將本實驗室的測定結(jié)果與安捷倫科技(中國)有限公司上海分公司實驗室(簡稱安捷倫實驗室)的安捷倫7700x電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的測定結(jié)果進(jìn)行比對,觀察不同實驗室間結(jié)果的差異。

      1.3.6 參考區(qū)間的建立 選取2016年7月杭州地區(qū)體檢正常者495名,其中男242名、女253名,年齡2~50歲。按年齡分為≤16歲組(254名)和>16歲組(241名)。采用肝素鈉抗凝真空采血管采集靜脈全血樣本,充分搖勻,2~8 ℃保存待測,采用ICP-MS檢測5種元素,建立正常人群的參考區(qū)間。

      1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

      采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)性檢驗結(jié)果顯示所有數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布,以x ±s表示,組間比較采用t檢驗,以x ±2s方式建立參考區(qū)間。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 線性評價及最低定量限(limit of quantitation,LOQ)

      以標(biāo)準(zhǔn)點濃度為X,對應(yīng)元素CPS與內(nèi)標(biāo)CPS比率為Y,建立線性回歸方程,r值為0.999 6~1.000 0。5種元素線性均良好。見表1。

      重復(fù)檢測超純水11次,計算標(biāo)準(zhǔn)偏差,以10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為該法的LOQ,見表1。

      2.2 基質(zhì)效應(yīng)

      相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.7%~6.0%,稀釋之后基質(zhì)對檢測結(jié)果基本無影響。見表2。

      2.3 精密度驗證

      采用ICP-MS檢測低、中、高水平樣本,F(xiàn)e、Mg、Ca、Zn、Cu的批內(nèi)CV為0.31%~3.62%,批間CV為1.37%~7.15%。見表3。

      2.4 添加回收試驗

      將L2、L3處理后分別檢測6次,求得L2、L3均值,F(xiàn)e、Mg、Ca、Zn、Cu對應(yīng)的添加回收率為98.2%~112.7%,符合要求(100%±20%)。見表4。

      表1 5種元素線性回歸方程及線性范圍

      表2 5種元素基質(zhì)效應(yīng)分析

      表3 5種元素批內(nèi)、批間CV結(jié)果 (%)

      表4 添加回收試驗結(jié)果

      2.5 室間比對分析

      本實驗室測定結(jié)果與安捷倫實驗室的平均相對偏差為0.61%~5.56%,本方法準(zhǔn)確度滿足要求,可用于大樣本分析。見表5。

      表5 室間比對分析結(jié)果

      2.6 臨床應(yīng)用及參考區(qū)間統(tǒng)計

      男、女性之間5種元素差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。按年齡劃分為未成年組(≤16歲)和成年組(>16歲),成年組與未成年組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。未成年組Cu元素比成年組低1.0%,Ca元素比成年組高8.5%,Mg元素比成年組高4.3%,F(xiàn)e元素比成人組低2.4%,Zn元素比成年組低24.4%。以x ±2s計算參考區(qū)間。見表6、表7。

      表6 成年組與未成年組Mg、Ca、Fe、Cu 、Zn結(jié)果的比較 (mg/L,x±s)

      表7 Mg、Ca、Fe、Cu、Zn的參考區(qū)間 (mg/L)

      3 討論

      隨著人們對營養(yǎng)要求關(guān)注的增加,各種食品中或多或少會添加單一元素或復(fù)合元素,以補充人體所需的微量元素[14]。本研究結(jié)果顯示,未成年人Zn水平相對較低,與文獻(xiàn)報道[15-16]一致,因此需引起臨床重視,但也不可盲目補充,應(yīng)結(jié)合相應(yīng)檢測結(jié)果適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行控制或補充。

      ICP-MS是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的較新的檢測技術(shù),其將ICP的高溫電離特性與四極桿質(zhì)譜的高敏感性相結(jié)合,形成一種新型的同位素分析、元素分析和形態(tài)分析技術(shù),具有檢出線性范圍寬、檢出限低、干擾因素少、基質(zhì)效應(yīng)低、分析精密度高、分析速度快等特性,廣泛應(yīng)用于環(huán)境、化工、食品、醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域。本研究結(jié)果顯示,ICP-MS檢測全血Fe、Mg、Ca、Zn、Cu的線性關(guān)系良好,批內(nèi)、批間精密度均符合臨床檢測要求,同時還初步建立了杭州地區(qū)未成年人與成年人全血5種元素的參考區(qū)間。

      綜上所述,ICP-MS具有敏感性高、抗干擾能力強、準(zhǔn)確度高及穩(wěn)定性好的優(yōu)點,可同時檢測Fe、Mg、Ca、Zn、Cu元素,而且臨床適用性較好,可為臨床相關(guān)疾病的診斷提供參考依據(jù)。

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