葡萄糖饑餓對HeLa細胞形態(tài)與結構的影響

曾 杰， 陳 佳， 邵鄰相， 蘇佳佳

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

葡萄糖作為真核生物的主要能源物質和新陳代謝中間產(chǎn)物，對生物體的生長發(fā)育具有重要作用，因此，體內葡萄糖水平對生物體的健康具有重要影響.近幾年的研究表明:體內高濃度的葡萄糖可增加大多數(shù)癌癥的發(fā)病機率[1]，并可促進癌細胞的增殖、轉移和粘附[2];低濃度葡萄糖有益于人體對抗由高糖分解癌癥和轉移性腫瘤(HGCM)引發(fā)的疾病[3]，并可降低癌細胞的增殖[4]．

腫瘤細胞表現(xiàn)出異常的新陳代謝，其葡萄糖的攝取和利用速度增加，糖酵解代謝增強，胞外乳酸堆積增多，腫瘤細胞從細胞外環(huán)境攝取的葡萄糖的量大約是正常細胞的10多倍[5]．葡萄糖為腫瘤細胞的生長提供了充分的能量，因此，通過剝奪葡萄糖的癌癥治療方法受到人們的廣泛關注．文獻[6]首次解析了人源葡萄糖轉運蛋白GLUT1的晶體結構，有可能實現(xiàn)葡萄糖轉運的人工干預，通過特異性阻斷對癌細胞的葡萄糖供應，抑制癌細胞生長．文獻[7]用碳酸氫鈉去除腫瘤內的氫離子，可破壞乳酸根和氫離子的協(xié)同作用，從而快速有效地殺死處于葡萄糖饑餓或缺乏的腫瘤細胞．葡萄糖饑餓是指通過降低培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度而對細胞進行饑餓處理．本實驗通過對HeLa細胞進行葡萄糖饑餓處理，觀察細胞形態(tài)與結構的變化，為腫瘤的限食療法提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為蘭州百靈生物技術有限公司產(chǎn)品；無糖DMEM培養(yǎng)基、葡萄糖、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、吖啶橙(AO)、溴化乙錠(EB)、牛血清蛋白(BSA)、Anti-α-Tubulin鼠多克隆抗體和鬼筆環(huán)肽(FITC-Phallodin)為Sigma公司產(chǎn)品；Alexa Fluor?488驢抗鼠IgG為Invitrogen公司產(chǎn)品；3111型CO2細胞培養(yǎng)箱為熱電公司產(chǎn)品；iMark Microplate Reader為Bio-Rad公司產(chǎn)品；TS-100型倒置顯微鏡為尼康公司產(chǎn)品；S-4800日立掃描電子顯微鏡(SEM)為Hitachi公司產(chǎn)品；TCS SP5Ⅱ激光共聚焦掃描顯微鏡為Leica公司產(chǎn)品．

1.2 細胞培養(yǎng)

0.0,1.0,1.5,2.0和25.0 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基由無糖培養(yǎng)基配置；對照組培養(yǎng)基內葡萄糖濃度為25.0 mmol/L．培養(yǎng)方法參照文獻[8]．

1.3 葡萄糖饑餓最適葡萄糖濃度的篩選

根據(jù)人體內的葡萄糖濃度(5.5 mmol/L)及參考文獻[9]，設置葡萄糖濃度梯度為0.0，1.0，1.5和2.0 mmol/L(以上濃度未計算細胞培養(yǎng)時加入的原胎牛血清中的5.5 mmol/L糖濃度)的培養(yǎng)基，分別處理HeLa細胞24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，培養(yǎng)3 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入75 μL DMSO，震蕩15 min，酶標儀570 nm下測定吸光度值，并計算抑制率．

1.4 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)

HeLa細胞經(jīng)葡萄糖饑餓分別處理24，48及72 h后，倒置顯微鏡下進行觀察，拍照．

1.5 熒光染色觀察細胞核形態(tài)

HeLa細胞經(jīng)葡萄糖饑餓分別處理24，48及72 h后，取出細胞爬片，磷酸鹽緩沖液清洗3次．臨用前將AO(5 μg/mL)和EB(5 μg/mL)溶液等體積混合．在爬片上滴加混合液進行染色，熒光顯微鏡觀察，拍照．

1.6 掃描電鏡觀察細胞表面超微結構

HeLa細胞經(jīng)葡萄糖饑餓處理48 h后，使用掃描電子顯微鏡觀察細胞表面結構，實驗方法參照文獻[10]．

1.7 激光共聚焦免疫熒光觀察細胞骨架

HeLa細胞經(jīng)葡萄糖饑餓處理48 h后，3.7%甲醛溶液4 ℃固定過夜；磷酸鹽緩沖液清洗3次；0.1%TritonX-100透膜20 min，磷酸鹽緩沖液清洗3次；5%BSA室溫封閉30 min；α-Tubulin鼠多克隆抗體(1%BSA稀釋液1∶1 000)4 ℃過夜；磷酸鹽緩沖液清洗3次；Alexa Fluor?488驢抗鼠IgG(1∶1 000)室溫避光孵育30 min；磷酸鹽緩沖液清洗3次；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液染色10 min，磷酸鹽緩沖液清洗2次，雙蒸水漂洗2次；加防熒光淬滅劑，4 ℃晾干，封片；在激發(fā)光為496 nm，發(fā)射光范圍為515～525 nm條件下觀察，拍照．微絲(F-Actin)染色方法：3.7%甲醛溶液4 ℃固定過夜；磷酸鹽緩沖液清洗3次；FITC-Phalloidin染色(1%BSA稀釋液1∶40)室溫避光孵育30 min；以下操作步驟同上．

1.8 統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 葡萄糖饑餓最適葡萄糖濃度的篩選結果

如表1所示：HeLa細胞經(jīng)葡萄糖饑餓處理24 h后，葡萄糖濃度為0.0，1.0，1.5和2.0 mmol/L組細胞增殖抑制率分別為56.16%，36.30%，25.00%和16.44%．細胞增殖抑制率隨著葡萄糖濃度的降低而逐漸升高．為了實驗的方便性與準確性，選擇1.0 mmol/L葡萄糖濃度作為葡萄糖饑餓的最適處理濃度．

表1 葡萄糖饑餓24 h最適葡萄糖濃度的篩選

注：與對照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01．

2.2 葡萄糖饑餓對細胞形態(tài)的影響

如圖1所示：HeLa細胞經(jīng)葡萄糖饑餓處理24 h后，對照組和25.0 mmol/L組的細胞生長良好，細胞形態(tài)無明顯變化，其分布均勻，貼壁性好，形態(tài)飽滿；1.0 mmol/L組的細胞密度減小，少數(shù)細胞收縮變圓；0.0 mmol/L組的細胞大多數(shù)都收縮變圓．48 h后，對照組和25.0 mmol/L組的細胞密度變大，細胞形態(tài)正常；1.0 mmol/L組的細胞大多數(shù)變圓；0.0 mmol/L組的細胞幾乎全部變圓．72 h后，對照組和25.0 mmol/L組的細胞生長狀態(tài)較好，增殖速度快，細胞間出現(xiàn)相互擠壓的現(xiàn)象，但細胞貼壁性好，形態(tài)飽滿；1.0 mmol/L與0.0 mmol/L組的細胞幾乎全部變圓．

A：對照組；B：c(葡萄糖)=25.0 mmol/L組；C：c(葡萄糖)=1.0 mmol/L組；D：c(葡萄糖)=0.0 mmol/L組.標尺長度為50 μm

2.3 葡萄糖饑餓對HeLa細胞核的影響

如圖2所示：HeLa細胞經(jīng)葡萄糖饑餓分別處理24，48及72 h后，AO/EB雙重熒光染色觀察細胞核染色質的分布，吖啶橙(AO)能透過完整的細胞，嵌入細胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光，溴化乙錠(EB)僅能透過胞膜受損的細胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光．葡萄糖饑餓24 h后，對照組、25.0 mmol/L組的細胞結構完整，呈分布均勻的綠色熒光，細胞核完整，邊界清晰；1.0 mmol/L組的少部分細胞發(fā)生膜皺縮，胞漿稀少，細胞收縮變圓，體積減小，核染色體固縮、邊聚，出現(xiàn)凋亡小體等細胞凋亡特征；0.0 mmol/L組多數(shù)細胞的細胞核被染成黃色，處于中期凋亡狀態(tài)．48 h后，對照組、25.0 mmol/L組的細胞結構完整，呈分布均勻的綠色熒光；1.0 mmol/L組多數(shù)細胞的細胞核被染成黃色，處于中期凋亡狀態(tài)；0.0 mmol/L組細胞幾乎全部被染成橙紅色，處于晚期凋亡的狀態(tài)．72 h后，對照組、25.0 mmol/L組的細胞結構完整，呈分布均勻的綠色熒光；1.0 mmol/L組與0.0 mmol/L組細胞全部被染成橙紅色，處于晚期凋亡的狀態(tài)．

2.4 葡萄糖饑餓對HeLa細胞表面超微結構的影響

由圖3可見：HeLa細胞經(jīng)葡萄糖饑餓處理48 h后，對照組和25.0 mmol/L組細胞形態(tài)飽滿，多呈規(guī)則的梭形或多角形，貼壁性好，細胞表面具有豐富的微絨毛，偽足發(fā)達且延展性好，相鄰細胞的偽足相互緊密連接．1.0 mmol/L組的細胞形狀變圓，體積縮小，貼壁性降低，細胞表面的微絨毛和偽足等結構幾乎全部消失，出現(xiàn)凋亡小體結構．0.0 mmol/L組的細胞收縮變圓，體積進一步縮小，細胞表面的微絨毛和偽足等結構近乎完全消失，細胞膜出現(xiàn)褶皺．

A：對照組；B：c(葡萄糖)=25.0 mmol/L組；C：c(葡萄糖)=1.0 mmol/L組；D：c(葡萄糖)=0.0 mmol/L組.標尺長度為25 μm

A：對照組；B：c(葡萄糖)=25.0 mmol/L組；C：c(葡萄糖)=1.0 mmol/L組；D：c(葡萄糖)=0.0 mmol/L組圖3 掃描電鏡觀察葡萄糖饑餓對HeLa細胞表面超微結構的影響

2.5 葡萄糖饑餓對HeLa細胞微管分布的影響

由圖4可見：HeLa細胞經(jīng)葡萄糖饑餓處理48 h后，對照組和25.0 mmol/L組細胞輪廓清晰，立體感強；微管從微管組織中心散發(fā)呈輻射狀，圍繞在細胞核周圍，均勻地分布在整個細胞中．微管著色均一，連貫性好，呈清晰的絲狀纖維結構．1.0 mmol/L組細胞整體輪廓清晰度下降，呈圓形或三角形，可見凋亡小體；微管蛋白解聚，聚集于細胞邊緣，絲狀纖維結構消失．0.0 mmol/L組細胞收縮變小，呈圓形；微管蛋白完全解聚，聚集于細胞邊緣兩端，絲狀纖維結構消失．

A：對照組；B：c(葡萄糖)=25.0 mmol/L組；C：c(葡萄糖)=1.0 mmol/L組；D：c(葡萄糖)=0.0 mmol/L組圖4 激光共聚焦免疫熒光觀察葡萄糖饑餓對HeLa細胞微管分布的影響

2.6 葡萄糖饑餓對HeLa細胞微絲分布的影響

由圖5可見：HeLa細胞經(jīng)葡萄糖饑餓處理48 h后，對照組和25.0 mmol/L組細胞形態(tài)規(guī)則，立體感強，肌動蛋白絲聚合形成束狀結構并分布于細胞邊緣，細胞間連接緊密．1.0 mmol/L組細胞的細胞核收縮變圓，輪廓模糊．細胞收縮變小，呈圓形或三角形．肌動蛋白絲消失，表面微絨毛減少，細胞間的連接減少或中斷．0.0 mmol/L組細胞進一步收縮變圓，微絲蛋白解聚，著色變淺，細胞表面微絨毛完全消失．

A：對照組；B：c(葡萄糖)=25.0 mmol/L組；C：c(葡萄糖)=1.0 mmol/L組；D：c(葡萄糖)=0.0 mmol/L組圖5 激光共聚焦免疫熒光觀察葡萄糖饑餓對HeLa細胞微絲分布的影響

3 討 論

在葡萄糖饑餓條件下，降低癌細胞的異常新陳代謝，誘導癌細胞的凋亡[11]．Foster等[9]用0.0，0.5和25.0 mmol/L葡萄糖濃度的條件處理多種腫瘤細胞120 h.結果表明，0.0 mmol/L葡萄糖濃度處理組的所有腫瘤細胞的生長均受到抑制作用；0.5 mmol/L葡萄糖濃度處理可以抑制多種腫瘤細胞的生長．閆珊[12]研究發(fā)現(xiàn)，缺糖能降低HeLa細胞的生存率，并誘導細胞發(fā)生凋亡．本實驗通過對HeLa細胞進行葡萄糖饑餓處理，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)，細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞由規(guī)則的梭形或多角形逐漸轉變成三角形或圓形，并出現(xiàn)凋亡小體等凋亡特征，這與閆珊等[12]的研究結果相一致；AO/EB染色結果顯示，細胞膜皺縮，胞漿稀少，細胞收縮變圓，體積減小，核染色體固縮，邊聚，出現(xiàn)凋亡小體等細胞凋亡特征，這與蔣時紅等[13]的研究結果相一致；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：細胞表面的微絨毛和偽足等結構近乎完全消失，細胞膜出現(xiàn)褶皺；免疫熒光檢測結果顯示：微絲蛋白減少，細胞形態(tài)發(fā)生改變，微管結構被破壞，微管蛋白解聚并聚集于細胞邊緣，并且隨著葡萄糖饑餓葡萄糖濃度的降低，細胞骨架被破壞的程度加深．

綜上所述，葡萄糖饑餓條件下，HeLa細胞表面的微絨毛和偽足結構消失，微絲蛋白減少，排列混亂，微管蛋白解聚并聚集于細胞邊緣，絲狀纖維結構消失，染色質凝集，進而誘導HeLa細胞形態(tài)變化和凋亡．葡萄糖饑餓能夠抑制HeLa細胞活性，改變細胞形態(tài)，誘導細胞凋亡，這為臨床上饑餓療法治療腫瘤提供理論依據(jù)．

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