甲狀腺素對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞miR-let-7a基因表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響

高慧珍，陳理星，黃敏婕，徐寧迎

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

甲狀腺激素（Thyroid Hormone，TH）是哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的激素之一，幾乎作用于機(jī)體的每個(gè)細(xì)胞[1]。TH通過與機(jī)體全身各處的靶細(xì)胞核內(nèi)受體（Thyroid Hormone Receptor，TR）結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)功能[2]。TR作為一種轉(zhuǎn)錄因子會(huì)調(diào)控非編碼RNA。miR-let-7最早在線蟲（Nematoda）中發(fā)現(xiàn)，是線蟲發(fā)育的時(shí)間調(diào)控器[3]，被認(rèn)為是miRNA的代表，miR-let-7a是let-7家族非常重要的成員。隨著研究的不斷深入，let-7a在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞的分化[4]、增殖[5]與凋亡等方面發(fā)揮越來越重要的作用。很多研究數(shù)據(jù)顯示，miR-let-7a基因在一些癌變組織中下調(diào)并且這種下調(diào)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生癌變[6-7]，miR-let-7a基因的表達(dá)在前列腺癌組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)，其能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0～G1期從而抑制前列腺癌細(xì)胞的增長(zhǎng)[8]。目前，關(guān)于甲狀腺素（T4）等外源激素處理對(duì)miR-let-7a基因在細(xì)胞中表達(dá)影響的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以豬的腸道上皮細(xì)胞為模型添加不同濃度的T4后，以 real-time PCR為研究手段，檢測(cè)miR-let-7a基因的表達(dá)變化，利用CCK-8法測(cè)定處理過的細(xì)胞增殖率變化，為進(jìn)一步研究生理過程中miR-let-7a基因的表達(dá)變化奠定基礎(chǔ)，并初步探討了let-7a在T4影響下對(duì)腸道上皮細(xì)胞增殖的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 IPEC-J2（豬小腸上皮細(xì)胞）由浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物飼料所實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。

1.2 主要試劑與儀器 T4（英國(guó)abcam），D-MEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液（美國(guó)GIBCO），恒溫離心機(jī)，顯微鏡（Nikon，日本），NanoDrop2000c核酸分析儀，熒光定量 PCR 儀 Step oneplus PCR System（ABI），引物序列由上海Invitrogen公司合成，Trizol提取總RNA試劑，miRcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒，miRcute Plus miRNA qPCR 檢測(cè)試劑盒（TIANGEN，北京）。

1.3 細(xì)胞形態(tài)和增殖的檢測(cè) 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到70%左右，倒置顯微鏡下觀察處理組和空白對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)變化。細(xì)胞接種至96孔板，每孔約100 mL細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁后換成含有不同終濃度的T4培養(yǎng)液（0、0.02、0.03、0.05、0.075、0.1、0.2 μmol/L），每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)。作用48 h后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果，以換液的形式每孔加入10 mL的CCK-8，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞450 nm處的OD值。

1.4 細(xì)胞處理后提取RNA反轉(zhuǎn)錄 富集細(xì)胞后接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待每孔細(xì)胞貼壁 80%～90%后，添加上述不同濃度的T4激素，于37℃培養(yǎng)24 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。按照Trizol試劑提細(xì)胞總RNA，用NanoDrop2000c核酸分析儀檢測(cè)RNA濃度和純度，OD260/280均在1.8～2.0，濃度和純度都符合要求的RNA用miRcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5miR-let-7a基因熒光定量 本研究采用相對(duì)熒光定量qRT-PCR 法，內(nèi)參引物為Met-tRNA。用反轉(zhuǎn)錄的cDNA按照miRcute Plus miRNA qPCR 試劑盒說明書利用通用引物和特定的miRNA引物在Step one plus PCR System（ABI）儀器上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系：2×miRcute Plus miRNA Premix（ 含 SYBR， 含 ROX）10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.4 μL，miRNA第 1 鏈 cDNA 2 μL，50× ROX Reference Dye 2 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：95℃起始模板變性15 min；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增參數(shù)

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用2-ΔΔCt方法來計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析不同濃度T4作用下miR-let-7a的表達(dá)差異性，采用LSD進(jìn)行多重比較。采用單因素方差分析細(xì)胞增殖率的差異性。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。結(jié)果數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 T4對(duì)豬腸道上皮細(xì)胞形態(tài)及增殖率的影響 由圖1、2可知，處理組和空白對(duì)照組細(xì)胞的形態(tài)無差異。如圖3所示，當(dāng)T4濃度為0.03 μmol/L時(shí)細(xì)胞增殖率顯著低于其他濃度組（P＜0.05）。T4濃度從0增至0.03 μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖率逐漸減小，從0.03 μmol/L增至0.075 μmol/L時(shí)細(xì)胞增殖率逐漸增加，濃度大于0.075 μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖率基本保持不變。

圖1 空白組細(xì)胞形態(tài)

圖2 T4處理組細(xì)胞形態(tài)

圖3 不同T4濃度下細(xì)胞增殖率

2.2 熒光定量結(jié)果 熒光定量擴(kuò)增曲線和熔解曲線如圖4～5所示，本實(shí)驗(yàn)中熒光定量PCR反應(yīng)特異性和重復(fù)性良好，表達(dá)定量檢測(cè)結(jié)果可靠。采用2-ΔΔCt方法來計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖6所示。在添加0.03 μmol/L T4時(shí)，小腸上皮細(xì)胞miRlet-7a的表達(dá)豐度最高，極顯著高于其他濃度（P＜0.01）。T4濃度為0～0.03 μmol/L時(shí)，隨著添加劑量的增加let-7a的表達(dá)升高；T4濃度從0.05～0.2 μmol/L變化時(shí)，let-7a的表達(dá)呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。

圖4 熒光定量PCR熔解曲線

圖5 熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

3 討 論

圖6 miR-let-7a的相對(duì)表達(dá)量

苗治國(guó)[9]發(fā)現(xiàn)，在生長(zhǎng)發(fā)育期間（35～125日齡）長(zhǎng)白豬的平均日增重比金華豬高出39.44%，而其平均耗料增重比則比金華豬顯著低24.11%，但平均日采食量在2個(gè)品種間無顯著差異，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)金華豬小腸黏膜絨毛高度在80日齡和120日齡時(shí)均極顯著低于長(zhǎng)白豬。小腸吸收主要通過腸道微絨毛實(shí)現(xiàn)，小腸絨毛的增高可以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，絨毛的高度和腸細(xì)胞數(shù)量呈顯著相關(guān)。由此可以推測(cè)，金華豬和長(zhǎng)白豬對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的差異受腸道上皮細(xì)胞的增殖數(shù)目影響。之前的實(shí)驗(yàn)中已檢測(cè)到miR-let-7a在小腸中的表達(dá)量顯著高于其他組織[10]，說明let-7a在腸道細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用。大白豬出生后血液中TH水平隨著日齡的增加而變化，TH表達(dá)水平的下降可能會(huì)直接或間接上調(diào)miR-let-7a的表達(dá)量[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，T4濃度從0～0.03 μmol/L變化時(shí)，let-7a的表達(dá)量逐漸升高，濃度從0.03～0.2 μmol/L變化時(shí)，let-7a的表達(dá)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，濃度為0.03 μmol/L時(shí)表達(dá)量極顯著高于其他濃度組。同時(shí)檢測(cè)不同濃度作用對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、增殖產(chǎn)生的影響。利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示當(dāng)T4添加濃度從0～0.03 μmol/L變化時(shí)，細(xì)胞增殖率隨濃度增加而降低，從0.03 μmol/L增至0.075 μmol/L時(shí)，增殖率升高，濃度大于0.075 μmol/L增殖率雖有降低但基本保持不變。當(dāng)T4濃度為0.03 μmol/L時(shí)細(xì)胞的增殖率顯著低與其他濃度組。由此可見，let-7a的表達(dá)量與細(xì)胞增殖率呈負(fù)相關(guān)。miR-let-7a基因在細(xì)胞增殖與凋亡等方面發(fā)揮越來越重要的作用[5]。let-7a的上調(diào)對(duì)甲狀腺細(xì)胞凋亡存在一定的影響[12]，let-7a有抑制胃癌細(xì)胞增殖遷移等作用[13-14]。雖然現(xiàn)在已有較多關(guān)于let-7a影響癌細(xì)胞增殖的研究，但let-7a對(duì)正常細(xì)胞的增殖是否有影響很少有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，let-7a在一定濃度的T4下高表達(dá)，對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用，和之前在癌細(xì)胞上的研究結(jié)果一致[13-14]。

4 結(jié) 論

一定濃度的T4抑制細(xì)胞增殖而不影響腸道上皮細(xì)胞的形態(tài)。當(dāng)T4濃度為0.03 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的增殖率顯著低與其他濃度組。T4濃度影響let-7a在腸道上皮細(xì)胞中的表達(dá)量，且let-7a表達(dá)量與細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān)。T4濃度為0.03 μmol/L時(shí)let-7a的表達(dá)量極顯著高于其他濃度組。let-7a在腸道上皮細(xì)胞的表達(dá)受T4的調(diào)節(jié)，推測(cè)T4對(duì)細(xì)胞增殖的影響可能是通過調(diào)控let-7a的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

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