金魁獼猴桃RT-qPCR內(nèi)參基因的篩選

張計(jì)育，黃勝男，王 濤，潘德林，翟 敏，郭忠仁

（江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，南京210014）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Reverse transcription quantitative real-time PCR，RT-qPCR）技術(shù)是對(duì)PCR反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、速度快等優(yōu)點(diǎn)，已成為研究基因功能的重要方法之一。選擇較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因是利用RT-qPCR方法進(jìn)行基因表達(dá)分析的基礎(chǔ)。目前，常用的內(nèi)參基因有肌動(dòng)蛋白基因（Actin，ACT）、18S rRNA基因、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因、微管蛋白基因（Tubulin）等。RT-qPCR反應(yīng)中所需的內(nèi)參基因在各種類型的組織、細(xì)胞和各種試驗(yàn)因素條件下均需恒定表達(dá)。近年來，關(guān)于RT-qPCR試驗(yàn)內(nèi)參基因的選擇已經(jīng)在許多物種中進(jìn)行了研究，包括葡萄［1］、甘蔗［2］、白楊［3］、香蕉［4］、荔枝［5］、柑橘［6］、木瓜［7］、蘋果［8］、桃［9］等，發(fā)現(xiàn)沒有一個(gè)內(nèi)參基因在任何組織、任何試驗(yàn)條件下絕對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)。目前，關(guān)于獼猴桃組織特異性表達(dá)中內(nèi)參基因選擇的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)以獼猴桃（Actinidia deliciosa）優(yōu)良品種‘金魁’為材料，研究 6個(gè)常用的內(nèi)參基因在不同組織中的表達(dá)特性，并利用 geNorm［10］、NormFinder［11］、BestKeeper［12］3種軟件分別評(píng)價(jià)6個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，以期為研究獼猴桃各組織中基因表達(dá)分析選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為‘金魁’獼猴桃5年生扦插苗，2016年4—5月取其根、莖、葉、花瓣、花萼、雌蕊、子房、幼果（花后10 d），于液氮中速凍保存用于后續(xù)RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA的合成

RNA的提取采用改良的CTAB法［13］。RNA的完整性用2%的瓊脂糖凝膠溴化乙錠染色檢測(cè)。RNA濃度和純度通過在NanDropND-2000分光光度計(jì)上測(cè)230 nm、260 nm、280 nm的值確定。cDNA合成采用能消除殘留DNA的試劑盒PrimeScript RT reagent kitwith gDNA Eraser（TaKaRa，Japan）進(jìn)行，每個(gè)RNA樣品取1μg，具體方法參考說明書。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和RT-qPCR分析

選取6個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)以檢測(cè)其穩(wěn)定性，包括最常用的ACT基因、親環(huán)蛋白基因（Cyclophilin，CYP）、RNA聚合酶亞基2基因（RNA polymerase subunit2，RP2）、GAPDH基因、β-微管蛋白基因（β-tubulin，TUB）、α-微管蛋白基因（α-tubulin，TUA）。其中 ACT基因的引物參照 Zhang等的報(bào)道［14］，其余5個(gè)內(nèi)參基因的序列來源于獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi），引物設(shè)計(jì)采用Beacon Designer軟件進(jìn)行，引物序列如表1。采用RT-qPCR方法確定內(nèi)參基因的表達(dá)水平，應(yīng)用Applied BiosystemsTM7300 Real Time PCR System，20μL反應(yīng)體積中包含1.5μL 10倍稀釋后的cDNA，0.3μL（10 pmol/L）上、下游引物，10μL SYBR熒光染料（TaKaRa code：DRR041A）和7.9μL無菌ddH2O。PCR反應(yīng)條件：94℃4 min；94℃30 s，60℃20 s，72℃43 s，40個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)之后，利用熱熔解曲線（55—95℃）監(jiān)控每個(gè)PCR擴(kuò)增的特異性。利用7300系統(tǒng)軟件和2－ΔCt方法分析候選基因的表達(dá)水平。

表1 獼猴桃6個(gè)內(nèi)參基因的引物序列Table1 Primer sequences of the 6 reference genes in kiwifruit

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

參照公式Q＝2ΔCt，根據(jù)每個(gè)擴(kuò)增樣品的Ct值計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量Q?！鰿t＝Ct x－Ct樣品（Ct x為所有樣品中最低的 Ct值，Ct樣品為每個(gè)樣品的 Ct值）。利用 geNorm［10］、NormFinder［11］、BestKeeper［12］3種軟件分別評(píng)價(jià)6個(gè)候選基因在獼猴桃不同組織中表達(dá)的穩(wěn)定性，比較穩(wěn)定值大小以確定適宜的內(nèi)參基因。

圖1 獼猴桃不同組織總RNA提取的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.1 Agarose gel analysis of total RNA extracted from different tissues of kiw ifruit p lant

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量分析

利用CTAB法從獼猴桃不同組織中提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明：獼猴桃所有樣品電泳圖譜28S rRNA和 18S rRNA條帶清晰（圖 1），無彌散帶，且28S rRNA亮于18S rRNA，說明在提取過程中幾乎沒有RNA降解現(xiàn)象。核酸定量檢測(cè)結(jié)果表明：在所有的RNA樣品中，其A260/A280比值介于1.90—2.15（表2），表明所提取的RNA較少有蛋白質(zhì)等的污染。同時(shí)，A260/A230的比值均大于2.0（表2），說明RNA純度較高，沒有糖類、鹽類和有機(jī)物質(zhì)等的污染。獼猴桃不同組織中總RNA的產(chǎn)量依材料不同存在較大的差別（表2），其中子房中的RNA含量最高，為1 105.7 ng/μL，花瓣中的含量最低，為398.79 ng/μL。以上結(jié)果表明，提取的RNA符合后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)的要求。

表2 獼猴桃不同組織總RNA提取質(zhì)量的比較Table 2 Comparison of the quality of total RNA extracted from different kiwifruit tissues

2.2 引物質(zhì)量檢測(cè)

為了確定所設(shè)計(jì)內(nèi)參基因引物擴(kuò)增的單一性，以獼猴桃葉片的第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果表明：6個(gè)內(nèi)參基因引物擴(kuò)增的熔解曲線均只有明顯的單一峰（圖3），說明所用引物都能特異性地?cái)U(kuò)增各內(nèi)參基因的相應(yīng)產(chǎn)物，不存在引物二聚體，RT-qPCR的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖2 獼猴桃內(nèi)參基因RT-qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線分析Fig.2 Melting curve analysis of RT-qPCR amplications product of kiwifruit reference genes

2.3 內(nèi)參基因在不同組織中表達(dá)特性分析

利用比較Ct法分析內(nèi)參基因在獼猴桃不同組織中的表達(dá)特性（圖3），結(jié)果表明：ACT和TUA基因在各組織中的表達(dá)量差異較小，表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。GAPDH、RP2、CYP、TUB基因在獼猴桃各組織中的表達(dá)量差異較大。GAPDH基因在根中的表達(dá)量最高，在花瓣中的表達(dá)量最低。RP2在葉中的表達(dá)量最高，其次是子房，在花萼中的表達(dá)量最低。CYP基因在根中的表達(dá)量最高，在莖中的表達(dá)量最低。TUB在莖中的表達(dá)量最高，其次是雌蕊，在花萼中的表達(dá)量最低。

2.4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

利用geNorm軟件計(jì)算出所有基因與其他候選基因所得配對(duì)變異值的平均值M，M值越小，表明所選的內(nèi)參基因越穩(wěn)定。結(jié)果表明：CYP、TUB、RP2、GAPDH、TUA、ACT基因的 M值依次為 1.577、1.317、1.121、0.804、0.340和0.340，即表達(dá)穩(wěn)定性由高到低為ACT＝TUA＞GAPDH＞RP2＞TUB＞CYP（表3）。根據(jù)NormFinder軟件分析可得（表3），ACT基因在獼猴桃不同組織中表達(dá)最為穩(wěn)定，為最適內(nèi)參基因，其次是TUA基因，CYP基因表達(dá)穩(wěn)定性最差。BestKeeper軟件的分析結(jié)果與NormFinder軟件分析結(jié)果相同（表3）?？梢缘贸觯珹CT基因是獼猴桃不同組織中表達(dá)最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

圖3 獼猴桃內(nèi)參基因在各組織中的表達(dá)特性分析Fig.3 Expression analysis of reference genes in different tissues of kiw ifruit p lant

表3 利用geNorm，Norm Finder和BestKeeper軟件計(jì)算的不同內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的順序Table 3 Ranking of candidate reference genes in order of their expression stability calculated by geNorm，Norm Finder and BestKeeper

3 討論

RT-qPCR是有效、快速、可靠的檢測(cè)基因表達(dá)的方法之一，在探索基因功能方面起到了重要的作用。通常情況下，在不同物種、不同品種、不同組織以及不同的試驗(yàn)條件，選擇的內(nèi)參基因是不同的。為了得到更加準(zhǔn)確的基因表達(dá)結(jié)果，在進(jìn)行基因表達(dá)研究之前，必須對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估，從而選擇更加穩(wěn)定合適的內(nèi)參基因。Yeap等［15］在5個(gè)不同的試驗(yàn)設(shè)計(jì)下對(duì)油棕中14個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行了穩(wěn)定性評(píng)估，結(jié)果表明：油棕生殖器官中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因是赤霉素響應(yīng)蛋白2基因（Gibberellin-responsive protein 2，GRAS）和鈣調(diào)蛋白基因（Glutaredoxin）；果皮不同發(fā)育階段表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因是GRAS和親環(huán)蛋白基因（Cyclophilin 2，Cyp2）；營(yíng)養(yǎng)器官和油棕其他器官中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因是Cyp2、GRAS和信使RNA前體剪切因子SLU7（Pre-mRNA splicing factor SLU7，SLU7）；油棕所有組織中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是GRAS。Upadhyay等［16］對(duì)葡萄中10個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行了穩(wěn)定性研究，發(fā)現(xiàn)在葉軸伸長(zhǎng)過程中，tubulin、EF1α和UBC基因穩(wěn)定表達(dá)，在花和漿果發(fā)育階段，PP2A、SAND、Sutra基因表達(dá)穩(wěn)定。Tong等［9］利用相關(guān)軟件對(duì)11個(gè)內(nèi)參基因在‘雨花1號(hào)’和‘京玉’桃不同cDNA樣品中表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)參基因TEF2、UBQ10和RP II在所有的供試樣品中表達(dá)穩(wěn)定，可以用于總樣品組合中桃果實(shí)果膠物質(zhì)降解相關(guān)基因的表達(dá)分析。Kim等［19］對(duì)李子中20個(gè)候選內(nèi)參基因在141個(gè)樣品中的表達(dá)進(jìn)行了穩(wěn)定性評(píng)估，發(fā)現(xiàn)SAND蛋白相關(guān)交換蛋白基因（SAND protein related trafficking protein，MON）、延長(zhǎng)因子 1α基因（Elongation factor 1 alpha，EF1α）、起始因子5A（Initiation factor 5A，IF5A）是所有樣品中表達(dá)較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因，可以用于基因表達(dá)研究。本研究對(duì)‘金魁’獼猴桃8個(gè)不同組織的6個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：ACT基因在不同組織的表達(dá)較為穩(wěn)定，可以作為基因在組織中表達(dá)研究的內(nèi)參基因。

［1］REID K E，OLSSON N，SCHLOSSER J，et al.An optimized grapevine RNA isolation procedure and statistical determination of reference genes for real-time RT-PCR during berry development［J］.BMC Plant Biology，2006，6：27.

［2］ISKANDAR H，SIMPSON R，CASU R，et al.Comparison of reference genes for quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of gene expression in sugarcane［J］.Plant Molecular Biology Reporter，2004，22：325-337.

［3］XU M，ZHANG B，SU X，et al.Reference gene selection for quantitative real-time polymerase chain reaction in Populus［J］.Analytical Biochemistry，2011，408（2）：337-339.

［4］CHEN L，ZHONG H Y，KUANG JF，et al.Validation of reference genes for RT-qPCR studiesof gene expression in banana fruitunder different experimental conditions［J］.Planta，2011，234（2）：377-390.

［5］ZHONGH Y，CHEN JW，LICQ，etal.Selection of reliable reference genes for expression studiesby reverse transcription quantitative real-time PCR in litchiunder different experimental conditions［J］.Plant Cell Reports，2011，30（4）：641-653.

［6］MAFRA V，KUBO K S，ALVES-FERREIRA M，et al.Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions［J］.PloSONE，2012，7（2）：e31263.

［7］ZHU X，LIX，CHENW，et al.Evaluation of new reference genes in papaya for accurate transcript normalization under different experimental conditions［J］.PloSONE，2012，7（8）：e44405.

［8］PERINIP，PASQUALIG，MARGIS-PINHEIRO M，et al.Reference genes for transcriptional analysis of flowering and fruit ripening stages in apple（Malus×domestica Borkh.）［J］.Molecular Breeding，2014，34（3）：829-842.

［9］TONG Z，GAO Z，WANG F，et al.Selection of reliable reference genes for gene expression studies in peach using real-time PCR［J］.BMC Molecular Miology，2009，10：71.

［10］VANDESOMPELE J，DE PRETER K，PATTYN F，etal.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes［J］.Genome Biology，2002，3（7）：research0034.1-0034.11.

［11］ANDERSEN C，JENSEN J，ORNTOFT T.Normalization of realtime quantitative reverse transcription-PCR data：A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization，applied to bladder and colon cancer data sets［J］.Cancer Res，2004，64：5245.

［12］PFAFFLMW，TICHOPAD A，PRGOMETC，et al.Determination of stable housekeeping genes，differentially regulated target genes and sample integrity：BestKeeper Excel-based tool using pair-wise correlations［J］.Biotechnology Letters，2004，26：509-515.

［13］張計(jì)育，杜小麗，渠慎春，等.一種簡(jiǎn)便的提取植物總RNA和DNA的方法［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27（3）：140-143.

［14］ZHANG B，CHEN K，BOWEN J，et al.Differential expression within the LOX gene family in ripening kiwifruit［J］.Journal of Experimental Botany，2006，57（14）：3825-3836.

［15］YEAPW-C，LOO JM，WONG Y C，et al.Evaluation of suitable reference genes for qRT-PCR gene expression normalization in reproductive，vegetative tissues and during fruit development in oil palm［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2013，116（1）：55-66.

［16］UPADHYAY A，JOGAIAH S，MASKE S R，et al.Expression of stable reference genes and SPINDLY gene in response to gibberellic acid application at different stages of grapevine development［J］.Biologia Plantarum，2015，59（3）：436-444.

［17］KIM H-Y，SAHA P，F(xiàn)ARCUH M，etal.RNA-Seq analysis of spatiotemporal gene expression patterns during fruit development revealed reference genes for transcript normalization in plums［J］.Plant Molecular Biology Reporter，2015，33（6）：1634-1649.