重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt11

劉 靜，武國干，吳 瀟，劉 華，王金斌，呂貝貝，蔣 瑋，唐雪明，3，4*

（1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海200090；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海201106；3農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（上海），上海201106；4上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海201106）

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究與應(yīng)用的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)的研究已成為全球轉(zhuǎn)基因生物安全管理的重要組成部分。PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中有著廣泛的應(yīng)用，但是常規(guī)的PCR檢測需要精密的熱循環(huán)儀以及復(fù)雜的實驗程序，難以滿足非實驗室環(huán)境下轉(zhuǎn)基因核酸成分快速篩查和檢測的需求。近年來，核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)得到了較快的發(fā)展。與常規(guī)PCR相比，核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)不需要熱循環(huán)儀器，可在恒溫條件下快速擴(kuò)增出目的片段，具有簡便、靈敏的特點。目前，主要的等溫擴(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Rolling circle amplification，RCA）以及重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase ploymerase amplification，RPA）等［1-2］。

RPA技術(shù)原理是模擬生物體內(nèi)DNA復(fù)制，由重組酶介導(dǎo)、在37℃下對目標(biāo)片段進(jìn)行等溫擴(kuò)增，實現(xiàn)單分子核酸檢測。RPA最大的特點是不需要通過高低溫度循環(huán)來實現(xiàn)核酸解鏈和退火，只需要1對引物即可在37℃恒溫、30 min以內(nèi)完成模板核酸的擴(kuò)增，與其他等溫擴(kuò)增技術(shù)相比具有明顯優(yōu)勢。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求較低，特別適合用于體外診斷、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域［3］。目前，該技術(shù)在轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測領(lǐng)域研究的還很少，但極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>

全球已經(jīng)商業(yè)化和正在研究的轉(zhuǎn)基因植物中，大多數(shù)與食品和飼料有關(guān)，主要有大豆、玉米、油菜、馬鈴薯、番茄等。玉米是世界上重要的糧食作物之一，基因工程技術(shù)最早應(yīng)用在玉米上是開發(fā)具有抗蟲和抗除草劑特性的轉(zhuǎn)基因玉米品系。瑞士先正達(dá)公司研發(fā)的轉(zhuǎn)基因玉米Bt11兼具抗蟲及耐除草劑兩種特性，其轉(zhuǎn)入的耐草丁膦除草劑基因是草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（Phosphinothricin acetyl transferase gene，PAT）。本研究基于RPA技術(shù)，根據(jù)外源基因PAT與載體骨架相連區(qū)段，設(shè)計上下游引物，特異性擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的邊界序列，擬建立轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的特異性RPA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因玉米Bt11含量5%、1%、0.1%的標(biāo)準(zhǔn)品，轉(zhuǎn)基因玉米GA21、Bt176、NK603均購自上海宜醇化工科技有限公司；非轉(zhuǎn)基因玉米購自國內(nèi)市場。

RPA凝膠檢測試劑盒（TwistAmp DNA Amplification Basic Kits）購自蘇州達(dá)麥迪生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；DNA提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。DNA Ladder Marker購自大連寶生物公司。RPA引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

植物種子粉末作為DNA提取材料，依照康為植物基因組提取試劑盒的操作手冊，進(jìn)行植物總DNA的提取，并測其濃度，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計與篩選

引物設(shè)計是RPA擴(kuò)增成功的關(guān)鍵因素，要求引物長度在30—35 bp，擴(kuò)增片段控制在100—200 bp［4-5］。本研究根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米Bt11外源基因PAT與載體骨架相連區(qū)段，依照RPA凝膠檢測試劑盒引物設(shè)計說明，設(shè)計6對引物用于篩選、建立檢測方法（表1）。

表1 RPA方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt11引物序列Table 1 Primers of RPA assay for GM maize Bt11

1.2.3 RPA反應(yīng)

RPA的反應(yīng)體系是50μL，向含有凍干酶粉的0.2 mL TwistAmp Basic反應(yīng)管中加入水合緩沖液（Rehydration Buffer）29.5μL，去離子水 12.2μL，上下游引物各 2.4μL（10μmol/L），植物基因組 DNA 1μL，最后加入醋酸鎂溶液2.5μL（280 mmol/L），充分混勻后將反應(yīng)試管放在37℃金屬浴中，恒溫反應(yīng)30 min。取反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)酚/氯仿抽提純化后，在2%瓊脂糖凝膠上以120 V恒壓電泳25 min，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行鑒定［6-7］。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因玉米Bt11特異性驗證

以轉(zhuǎn)基因玉米品系GA21、Bt176、NK603、Bt11的DNA為模板，驗證所篩選引物檢測Bt11的特異性。

1.2.5 RPA反應(yīng)時間和溫度優(yōu)化

時間優(yōu)化：以轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的DNA為模板，配置反應(yīng)體系，于37℃金屬浴中反應(yīng)，控制反應(yīng)時間分別為5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、40 min。反應(yīng)結(jié)束后立即加酚/氯仿抽提純化。

溫度優(yōu)化：以轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的DNA為模板，配置反應(yīng)體系，控制反應(yīng)時間為20 min，反應(yīng)溫度設(shè)定圍繞37℃，以5℃為梯度展開，分別設(shè)置為17℃、22℃、27℃、32℃、37℃、42℃、47℃、52℃。反應(yīng)結(jié)束后立即加酚/氯仿抽提純化。

1.2.6 靈敏度試驗

將已測定濃度的各樣品基因組 DNA用滅菌水稀釋成含量分別為1 000拷貝/μL、500拷貝/μL、200拷貝/μL、100拷貝/μL、50拷貝/μL及10拷貝/μL的溶液，作為模板進(jìn)行RPA擴(kuò)增，進(jìn)行絕對檢測限試驗。

轉(zhuǎn)基因玉米Bt11含量5%、含量1%、含量0.1%的DNA為直接提取所購標(biāo)準(zhǔn)品。用相同濃度的非轉(zhuǎn)基因玉米DNA將含量0.1%的Bt11玉米DNA稀釋成含量為0.05%、0.01%的DNA樣品，得到5%、1%、0.1%、0.05%、0.01%5個含量梯度的模板，進(jìn)行RPA擴(kuò)增，確定其相對檢測限。研究中所有擴(kuò)增的目標(biāo)片段均經(jīng)過測序驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性檢測Bt11引物篩選

如圖1所示，引物對F1/R1、F2/R2和F3/R3均未擴(kuò)增出目的條帶；F4/R4擴(kuò)增的條帶不明確；F5/R5出現(xiàn)目的條帶，但擴(kuò)增效率低；F6/R6出現(xiàn)明顯的目的條帶，且擴(kuò)增效率較高。

2.2 特異性檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt11驗證

對篩選的特異性引物對F6/R6進(jìn)行特異性驗證。如圖2所示，不含模板的空白和陰性對照（非轉(zhuǎn)基因玉米）中均無擴(kuò)增條帶，表明試驗過程無污染。只有含轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的反應(yīng)體系中出現(xiàn)188 bp的目的條帶，其他轉(zhuǎn)基因玉米品系GA21、Bt176、NK603中均無擴(kuò)增條帶。

圖1 特異性檢測Bt11引物篩選結(jié)果Fig.1 Screening of primers for specific detection of GM Bt11

圖2 特異性檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt11驗證Fig.2 Verification of specific detection of GM maize Bt11

2.3 反應(yīng)時間優(yōu)化和溫度優(yōu)化

如圖3所示，隨著反應(yīng)時間的延長，目的條帶亮度逐漸增強(qiáng)。反應(yīng)15 min時，已出現(xiàn)明顯的目的條帶；反應(yīng)20 min時，目的條帶更亮；反應(yīng)30 min和40 min，亮度與20 min相似，表明RPA反應(yīng)在20 min時，就已經(jīng)大量擴(kuò)增。

如圖4所示，反應(yīng)溫度在17℃、22℃與52℃時，無擴(kuò)增；在27℃與47℃時，有微弱擴(kuò)增；在32℃、37℃與42℃時均有擴(kuò)增，37℃與42℃時擴(kuò)增效率較高。

2.4 靈敏度檢測

分別取1.2.6所述6個濃度梯度的轉(zhuǎn)基因玉米Bt11 DNA稀釋液1μL作為模板，進(jìn)行RPA絕對檢測限檢測。如圖5所示，當(dāng) DNA含量為1 000拷貝/μL、500拷貝/μL、200拷貝/μL、100拷貝/μL時，均有188 bp的目的條帶；DNA含量為50拷貝/μL及10拷貝/μL時，無目的條帶；表明本試驗建立的RPA特異性檢測Bt11的絕對檢測限約為100拷貝/μL。

將1.2.6中5個百分含量梯度的Bt11作為模板，進(jìn)行RPA相對檢測限檢測。如圖6所示，當(dāng)Bt11的含量為5%、1%、0.1%時，出現(xiàn)188 bp的目的條帶；當(dāng)Bt11含量為0.05%、0.01%時，無目的條帶；表明建立的RPA反應(yīng)特異性檢測Bt11的相對檢測限約為0.1%。

圖3 反應(yīng)時間優(yōu)化Fig.3 Optim ization of reaction time

圖4 反應(yīng)溫度優(yōu)化Fig.4 Optim ization of reaction temperature

圖5 絕對靈敏度檢測Fig.5 Detection of absolute sensitivity

圖6 相對靈敏度檢測Fig.6 Detection of relative sensitivity

3 討論

隨著國際轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品商業(yè)化推廣的迅猛發(fā)展，為了搶占農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的制高點，我國在“十三五”規(guī)劃中重點強(qiáng)調(diào)了加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的研究和推進(jìn)商業(yè)化進(jìn)程。為了保障轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全有效的研發(fā)和管理，研究和應(yīng)用新型快速的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)是主管部門用于市場監(jiān)管和例行監(jiān)測的重要手段，也是落實我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度的有力技術(shù)支撐。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分的檢測根據(jù)檢測的靶標(biāo)不同分為4個層次，分別是通用元件篩選檢測、基因特異性檢測、構(gòu)建特異性檢測和品系特異性檢測。其中，構(gòu)建特異性檢測是在外源基因與載體骨架連接區(qū)序列設(shè)計引物［8］。本研究根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米Bt11外源基因PAT與載體骨架相連區(qū)段設(shè)計引物，屬于構(gòu)建特異性檢測方法。

RPA方法檢測的特異性、靈敏度與引物設(shè)計有很大關(guān)系，為建立更靈敏的RPA方法，根據(jù)不同的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的靶標(biāo)序列，需要進(jìn)行引物篩選。作為一項新興的技術(shù)，目前在農(nóng)產(chǎn)品檢測中，RPA引物的設(shè)計還沒形成可供參考的設(shè)計規(guī)則，傳統(tǒng)的PCR引物是不適用的，RPA引物比傳統(tǒng)PCR引物長，引物太短會影響重組率和擴(kuò)增效率［9］。本研究的經(jīng)驗：RPA引物的長度為30—35個核苷酸較適宜；擴(kuò)增片段長度為100—200 bp，擴(kuò)增效果較好；5’端的3—5個核苷酸應(yīng)當(dāng)避免聚鳥嘌呤，胞嘧啶在這里是有益的，能促進(jìn)片段的重組；對于3’端的3個核苷酸來說，鳥嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的穩(wěn)定結(jié)合，可以提升引物的擴(kuò)增性能；其他規(guī)則類似于普通PCR引物設(shè)計。

本研究顯示，RPA技術(shù)在37℃下擴(kuò)增時間為20 min時，就能出現(xiàn)明顯的條帶，并且只需要1對引物。相比較而言，LAMP需要在靶基因6個區(qū)域設(shè)計4—6種特異引物，且設(shè)計方法復(fù)雜，60℃下反應(yīng)60 min左右；而RPA操作簡單，反應(yīng)更快速，溫度要求低，不需要熱循環(huán)儀，只需簡單的恒溫加熱器，更適合應(yīng)用于條件較簡陋的基層衛(wèi)生機(jī)構(gòu)及野外條件下轉(zhuǎn)基因的檢測。本研究首次對轉(zhuǎn)基因玉米Bt11初步建立了RPA特異性檢測方法，在20min內(nèi)37℃下就可完成擴(kuò)增，其絕對檢測限約為100拷貝/μL，相對檢測限約為0.1%，遠(yuǎn)低于歐盟國家設(shè)定的轉(zhuǎn)基因最低限量0.9%，靈敏度高，可滿足相關(guān)行業(yè)的日常檢測需求。

本研究建立的特異性檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt11的RPA方法，短時間內(nèi)能實現(xiàn)對目的片段的指數(shù)擴(kuò)增，特異性強(qiáng)、靈敏性高，對環(huán)境設(shè)備要求低，操作簡便，在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測領(lǐng)域具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。

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