低溫脅迫對10份鵝觀草屬野生種質(zhì)抗寒生理指標(biāo)的影響

李長慧，李淑娟，劉艷霞，董添財，賈 科，梁德飛(.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 8006； .西藏自治區(qū)山南市瓊結(jié)縣農(nóng)牧綜合服務(wù)中心，西藏 山南 856800)

鵝觀草屬(Roegneria)是禾本科小麥族近緣屬中植物種類最多的多年生大屬?，F(xiàn)知全世界有4組20系126種，分布在北半球的溫帶、寒帶，我國有4組18系79種，主要分布在西北、西南、華北和東北等地區(qū)[1]。青海省分布的鵝觀草屬有26種[2]，其中多數(shù)種主要分布于海拔3 300～4 500 m的三江源地區(qū)，具有適口性好，抗逆性強等優(yōu)良特性，是高寒地區(qū)天然草地的重要組成成分和優(yōu)良的牧草[3]。三江源區(qū)獨特的生態(tài)區(qū)域和極端的氣候條件塑造了該區(qū)鵝觀草屬野生草種可以在極端寒冷、干旱和缺氧環(huán)境條件的生存特性，但原始生境不同的植物在低溫脅迫下的生理變化是有差異的，其抗寒性有強弱之分[4-5]。對牧草抗寒性生理研究是種質(zhì)資源評價的重要內(nèi)容之一。植物葉片中的葉綠素(Chl)含量，可溶性糖(SS)含量和質(zhì)膜透性以及一些氧化酶均與抗寒性有關(guān)[6-10]。低溫脅迫對植物細(xì)胞膜透性、Chl含量以及光合作用等生理活動產(chǎn)生不利影響[6,9,11-12]，同時植物在生理生化方面對低溫會產(chǎn)生適應(yīng)變化。例如，有些植物葉片產(chǎn)生較多的脫落酸，抑制莖的伸長；植物中可溶性糖等保護物質(zhì)增多，酶的活性發(fā)生變化[6,12]。本研究通過對低溫脅迫下鵝觀草屬10份材料的過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性變化、游離脯氨酸(Pro)累積、Chl和丙二醛(MDA)含量及質(zhì)膜相對透性等生理生化指標(biāo)變化的研究，探討和評價其抗寒性，旨為抗寒種質(zhì)篩選和優(yōu)良草品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

2014年自三江源區(qū)及其周邊地區(qū)采集到鵝觀草屬植物標(biāo)本200余份，經(jīng)過中科院西北生物研究所標(biāo)本館鑒定后，于2015年5月種植在青海大學(xué)牧草試驗站。選擇玉樹鵝觀草等為試驗材料(表1)，待供試材料在田間生長至具有4～5片真葉時，采集功能葉片裝入保鮮袋帶回實驗室，在低溫冰箱中進行人工模擬降溫處理，處理溫度分別為5、0、-5、-10、-15、-20、-25 ℃。低溫脅迫24 h測定 CAT和POD活性，Pro、MDA和SS含量以及細(xì)胞膜透性等生理生化指標(biāo)。

1.2 測定指標(biāo)和測定方法

細(xì)胞膜透性的測定采用電導(dǎo)法；Chl含量的測定采用熒光法； MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法； SS含量的測定采用蒽酮比色法； Pro含量測定采用磺基水楊酸法； CAT活性的測定采用高錳酸鉀滴定法； POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[13]。

1.3 抗寒性綜合評價方法

用隸屬函數(shù)法綜合各項指標(biāo)進行抗寒性評價[14]?？购载?fù)相關(guān)的參數(shù)，相對電導(dǎo)率、MDA采用降型分布函數(shù):U(xi) =(Ximax-Xij)/(Ximax-Ximin)；與抗寒性呈正相關(guān)的參數(shù)，脯氨酸、可溶性糖、過氧化氫酶采用升型分布函數(shù):U(xi)=(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)，其中U(xi)表示各指標(biāo)的隸屬度值，Xij表示各指標(biāo)值，Ximax和Ximin分別表示第i項指標(biāo)的最大值和最小值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 20.0對同種材料不同溫度處理間進行方差分析和差異顯著性檢驗，應(yīng)用Excel 2007制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對細(xì)胞膜透性的影響

植物受到低溫脅迫后細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)遭受破壞，膜的破壞程度可以通過細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲率的大小即電導(dǎo)率(Cond)來反映[4]。電導(dǎo)率相對越大說明植物體細(xì)胞破壞越嚴(yán)重，抗寒性就越弱[4]。隨著溫度的降低，10份鵝觀草屬植物材料的細(xì)胞膜透性總體呈上升趨勢(圖1)，其中玉樹鵝觀草A(瑪多)、玉樹鵝觀草B(鐵卜加)、玉樹鵝觀草E(興海)、短柄鵝觀草F(曲麻萊)、肅草H(澤庫西鋪沙)的上升比較平緩，而曲芒異芒草C(湟源)和曲芒異芒草G(澤庫)的上升幅度較大；由5 ℃降低到0 ℃時，電導(dǎo)率的變化幅度普遍較??；由0 ℃降低到-5 ℃時，B、C、D、G、H、J電導(dǎo)率增加顯著(P<0.05)；由-5 ℃降低到-15 ℃時，除I外各材料的電導(dǎo)率增加的幅度相對降低，但A、B、C、D、E、F、I電導(dǎo)率增加仍顯著；由-15 ℃降低到-20 ℃時，F(xiàn)、H、I、J的電導(dǎo)率增加的變化不顯著(P>0.05)；由-20 ℃降低到-25 ℃時，大多數(shù)材料電導(dǎo)率增加幅度較小，B、C、F、H、I、J的變化差異不顯著?？傮w來看，同種材料不同溫度間電解質(zhì)滲出率的增加幅度呈現(xiàn)出“小-大-小”的規(guī)律，其中，A、B、E、F、H的電解質(zhì)滲出率增加幅度較小，植物細(xì)胞膜受損較小；C、G電解質(zhì)滲出率增加幅度最大，植物細(xì)胞膜受損最大，說明曲芒異芒草C(湟源)和曲芒異芒草G(澤庫)的抗寒性較弱，玉樹鵝觀草A(瑪多)、玉樹鵝觀草B(鐵卜加)的抗寒性強。鵝觀草電解質(zhì)滲出率隨低溫脅迫加強呈現(xiàn)出持續(xù)增加的規(guī)律與銀邊扶芳藤(Euonymusfortunei)低溫脅迫[15]和對30份老芒麥(Elymussibiricus)種質(zhì)材料抗寒性[16]研究結(jié)果一致。與張尚雄等[17]對3種垂穗披堿草(Elymusnutans)的研究結(jié)果有所不同，在其試驗中，溫度降低到10 ℃后，電解質(zhì)滲出率不再增加，而是降低。

表1 供試材料來源Table 1 Origin of the experiment materials

圖1 低溫脅迫對鵝觀草幼苗細(xì)胞膜透性的影響Fig. 1 Effect of cold stress on the relative membrane permeability in leaves of seedlings

A、B、C、……、J表示材料編號，同表1，下同。

A, B, C，……, J indicate materials code in Table 1; similarly for the following figures.

2.2 低溫脅迫對丙二醛含量的影響

MDA是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，其含量高則說明低溫脅迫下植物受傷害的程度高[18]。 -15～5 ℃范圍內(nèi)，隨著脅迫溫度的降低，鵝觀草屬植物的MDA含量逐漸增加(圖2)；由-15 ℃降到-25 ℃，不同材料MDA含量變化不一樣，A、B、E、F、I是先升高后降低，D、H、J是先降低再升高，C是持續(xù)降低，G是持續(xù)升高的?？傮w來看，短柄鵝觀草F(曲麻萊,)在-20 ℃時MDA含量升高到最大值90.25 μmol·g-1，說明其遇到低溫脅迫后，調(diào)節(jié)MDA含量的保護酶系統(tǒng)協(xié)同作用弱，MDA含量增加，使其抗寒作用降低；曲芒異芒草C(湟源)在低溫脅迫過程中，MDA含量增加的幅度最小，為45.08 μmol·g-1。6種鵝觀草材料隨脅迫溫度降低，MDA含量先增加后降低的這種規(guī)律和張尚雄等[17]對垂穗披堿草低溫脅迫的試驗結(jié)果以及柏曉玲等[19]對燕麥(Avenasativa)幼苗低溫脅迫的試驗結(jié)果一致。

圖2 低溫脅迫對鵝觀草幼苗丙二醛含量的影響Fig. 2 Effect of cold stress on the MDA content in leaves of Roegneria seedlings

2.3 低溫脅迫對過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶(CAT)是細(xì)胞內(nèi)重要保護酶，可以清除逆境條件下細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的大量自由基，減輕膜脂過氧化作用，保護質(zhì)膜不受自由基的破壞。CAT活性高低間接地說明了植物抗寒性的強弱[6,12]。低溫脅迫由5 ℃降低到-25 ℃，鵝觀草CAT活性呈現(xiàn)先增加再降低的倒“V”型(圖3)。其中，A、B、D、E、F、H、I的峰值出現(xiàn)在-15 ℃，其中玉樹鵝觀草A(瑪多)的CAT活性最高，為79.97 mg·(g·min)-1。說明這幾種植物能積累較多的CAT來清除活性氧自由基而表現(xiàn)對逆境的抵抗；C、G、J的峰值出現(xiàn)在-5 ℃，CAT活性較早地開始降低，表明清除活性氧自由基的能力有限，表現(xiàn)對逆境抵抗的能力較差；曲芒異芒草C(湟源)不僅在-5 ℃就開始降低，而且其峰值僅為62.15 mg·(g·min)-1,CAT活性變化的幅度為12.68 mg·(g·min)-1，可推斷出其抗寒性較弱。韓發(fā)等[20]對不同海拔矮嵩草(Kobresiahumilis)中CAT活性比較結(jié)果為隨著海拔的升高，矮嵩草莖、葉中CAT活性都升高。因此，可理解為隨著海拔升高和氣溫降低，矮嵩草CAT活性升高。張志等[21]研究表明，高羊茅(Festucaelata)在5、0、-6 ℃低溫脅迫2、4、6、8 h， CAT活性的變化均為先升高再降低的趨勢。

圖3 低溫脅迫對鵝觀草幼苗CAT酶活性的影響Fig. 3 Effect of cold stress on the catalase activity in leaves of Roegneria seedlings

2.4 低溫脅迫對過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶(POD)主要起到防止H2O2的積累，避免超氧陰離子和H2O2反應(yīng)生成毒性更強的羥基自由基，從而減輕了低溫脅迫對植株的傷害[6,12]。隨著溫度降低，植物POD活性逐步升高，溫度降低到-15 ℃左右時，POD活性達到峰值，然后降低，呈倒“V”字型(圖4)。總體來看，不同植物材料低溫脅迫后POD活性的峰值有所不同，其中，玉樹鵝觀草A(瑪多)POD活性的峰值最高，為2 272 U·(g·min)-1，玉樹鵝觀草B(鐵卜加)POD活性峰值最低，為1 753 U·(g·min)-1。 H、I、J 的POD活性的峰值較高，C、D、E的POD活性的峰值較低。10種植物材料POD活性均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，說明這些鵝觀草屬植物在脅迫前期通過提高POD活性來消除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，抵御低溫帶來的傷害。 在低溫脅迫3種披堿草試驗中，在0-18 ℃，隨著溫度的降低披堿草POD活性提高[17]。在0-18 ℃間低溫脅迫9個野生早熟禾試驗中，葉片POD活性隨低溫脅迫的加劇而逐漸增大[22]。低溫脅迫下，5種酢漿草屬(Oxalis)植物的POD活性隨著處理溫度的降低呈先上升后下降趨勢，與本研究結(jié)果一致[23]。同一物種，由于分布區(qū)海拔不同，低溫脅迫下POD活性有所不同，如瑪多縣的玉樹鵝觀草較鐵卜加、興海縣分布的玉樹鵝觀草POD活性高。澤庫分布的曲芒異芒草較湟源縣分布的曲芒異芒草POD活性高。

2.5 低溫脅迫下可溶性糖含量變化

可溶性糖(SS)是主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物滲透調(diào)節(jié)中起著重要作用。植物積累的可溶性糖越多，低溫寒害程度越低。其機理是：植物在低溫脅迫后可溶性糖含量增加，細(xì)胞液濃度會提高，使冰點降低，減輕細(xì)胞的過度脫水，保護原生質(zhì)膠體不致遇冷凝固，從而表現(xiàn)出對低溫脅迫的適應(yīng)性[6,12]。不同鵝觀草材料低溫脅迫時均表現(xiàn)出可溶性糖含量隨溫度的降低而提高，在-20 ℃時達到峰值，然后隨著溫度的降低可溶性糖含量也降低。峰值最大的是玉樹鵝觀草A(瑪多),峰值最小的是曲芒異芒草C(湟源)(圖5)。 對9種野生早熟禾材料低溫脅迫試驗表明，在5～-20 ℃范圍內(nèi)，隨溫度的降低，早熟禾SS含量增加[22]，其結(jié)果與本研究結(jié)果是一致的。

圖4 低溫脅迫對鵝觀草幼苗POD酶活性的影響Fig. 4 Effect of cold stress on the POD activity in leaves of Roegneria seedlings

圖5 低溫脅迫對鵝觀草幼苗可溶性糖含量的影響Fig. 5 Effect of cold stress on the soluble sugar content in leaves of Roegneria seedlings

2.6 低溫脅迫對游離脯氨酸含量的影響

游離脯氨酸(Pro)是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。當(dāng)植物遭遇低溫時，細(xì)胞內(nèi)的游離Pro會持續(xù)增多，以降低細(xì)胞的滲透勢，從而增強水分保持力，達到抗寒的目的，Pro的積累是植物對低溫脅迫的適應(yīng)[6,12]。不同低溫脅迫對鵝觀草中游離Pro含量有顯著的影響(P<0.05)，隨著溫度的降低，10種供試材料中的游離Pro含量均有先升高后降低的趨勢(圖6)。各供試材料峰值均出現(xiàn)在-15 ℃，其中玉樹鵝觀草A(瑪多)、短柄鵝觀草F(曲麻萊)、短柄鵝觀草I(澤庫)的峰值較高，分別為438.79、445.34和422.24 μmol·g-1；峰值較低的是毛穗鵝觀草D(澤庫)，為353.62 μmol·g-1。同種植物相比較，瑪多的玉樹鵝觀草(A)低溫脅迫下Pro含量的峰值以及Pro含量的Δ值(不同溫度下Pro含量的差值)較鐵卜加的(B)和興海縣的(E)高；曲麻萊得短柄鵝觀草(F)低溫脅迫下Pro含量的峰值以及Pro含量的Δ值較澤庫的(G)高，這說明，分布在海拔高一些的鵝觀草在低溫脅迫下，體內(nèi)Pro含量升高的幅度大一些。這與對不同海拔矮嵩草葉中Pro含量比較研究的結(jié)果是一致的[20]。

圖6 低溫脅迫對鵝觀草幼苗葉片游離脯氨酸含量的影響Fig. 6 Effect of cold stress on the free proline content in leaves of Roegneria seedlings

圖7 低溫脅迫對鵝觀草幼苗葉綠素含量的影響Fig. 7 Effect of cold stress on the chlorophyll content in leaves of Roegneria seedlings

2.7 低溫脅迫對葉綠素含量的影響

葉綠素(Chl)的變化直接影響植物的光合作用，光合作用是主要的代謝活動之一。低溫脅迫下會加速植物體內(nèi)葉綠素的降解，葉綠素的變化與植物的抗寒性呈負(fù)相關(guān)[6,12]。一般情況下，低溫下葉綠素含量較高的植物，有利于光合作用，形成可溶性糖等溶質(zhì)，對抗寒有利[24]。 隨著溫度的逐漸降低，10種供試材料的葉綠素含量逐漸下降(圖7)，說明各種鵝觀草屬材料因持續(xù)低溫而使葉綠素合成受阻導(dǎo)致葉綠素含量也相對降低。這一結(jié)果與已報道的低溫脅迫對牧草葉綠素含量影響的結(jié)論一致[25-27]。

2.8 抗寒性綜合評價

運用隸屬函數(shù)法對測定的10個供試材料的7項生理指標(biāo)進行了綜合評定,并做了相關(guān)性分析，可以確定其抗寒性的強弱(表2)。結(jié)果表明，7項指標(biāo)(Pro含量、SS含量、MAD含量、CAT活性、POD活性、Chl含量以及細(xì)胞膜透性)與抗寒綜合評價值顯著相關(guān)(P<0.01)?？购杂蓮姷饺醯捻樞驗橛駱澌Z觀草A(瑪多)>玉樹鵝觀草B(鐵卜加)>玉樹鵝觀草E(興海縣)>肅草H(同仁)>曲芒異芒草C(湟源)>曲芒異芒草G(澤庫縣)>短柄鵝觀草F(曲麻萊)>紫穗鵝觀草J(麥秀林場)>短柄鵝觀草I(澤庫)>毛穗鵝觀草D(澤庫)。這一結(jié)果與鐵卜草改試驗站試驗田及青海大學(xué)試驗田的種植觀察結(jié)果基本相一致，如玉樹鵝觀草、肅草在鐵卜草改試驗站試驗田及青海大學(xué)試驗田中返青、長勢比曲芒異芒草、紫穗鵝觀草、毛穗鵝觀草和短柄鵝觀草明顯好一些，曲芒異芒草在鐵卜加試驗田中第2年的返青率較低[4-5，8-11，15-28，30]。

3 討論與結(jié)論

高寒地區(qū)植物的生長發(fā)育經(jīng)常會受到寒冷脅迫的影響，抗寒性比較強的植物在長期應(yīng)對低溫等逆境脅迫的過程中形成了功能獨特的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和細(xì)胞保護酶系[28]。本研究表明，低溫脅迫可誘導(dǎo)鵝觀草屬植物啟動抗寒響應(yīng)機制，在生理上產(chǎn)生了一系列的變化，具體表現(xiàn)：低溫脅迫使鵝觀草屬植物幼苗葉片內(nèi)積累更多的游離Pro、SS及水分等物質(zhì)，這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累可減輕滲透脅迫、降低冰點、增強保水能力、防止膜質(zhì)和蛋白質(zhì)的過氧化作用等；CAT、POD是清除活性氧的主要保護酶，低溫脅迫期間CAT可以分解鵝觀草屬植物體內(nèi)的過氧化氫，POD可降解過氧化氫，解除細(xì)胞內(nèi)有害自由基。通過POD和CAT保護酶系統(tǒng)協(xié)同作用，使自由基維持在一個低水平，從而防止自由基傷害。由于上述滲透調(diào)節(jié)作用和保護酶系統(tǒng)協(xié)同作用，鵝觀草屬植物細(xì)胞內(nèi)保護物質(zhì)增加，活性氧平衡，從而具有抗寒性，能夠適應(yīng)三江源區(qū)寒冷的氣候。供試材料在不同低溫脅迫下，細(xì)胞膜透性、Chl含量、MDA含量、SS含量、Pro含量以及CAT活性、POD活性等生理生化指標(biāo)均有顯著性變化，不同材料間變化幅度不同，電解質(zhì)滲出率的變化呈現(xiàn)持續(xù)增加，增加幅度為“小-大-小”的“S”曲線。所有供試材料MDA含量先一致逐步提高，后部分材料降低；CAT活性、POD活性、SS含量和Pro含量的變化規(guī)律呈現(xiàn)先增加再降低的倒“V”型； 9種供試材料的Chl含量持續(xù)降低；應(yīng)用隸屬函數(shù)法綜合評價鵝觀草屬各材料的抗寒性，抗寒性由強到弱順序：玉樹鵝觀草(瑪多)>玉樹鵝觀草(鐵卜加)>玉樹鵝觀草(興海)>肅草(同仁)>曲芒異芒草(湟源)> 曲芒異芒草(澤庫)>短柄鵝觀草(曲麻萊)>紫穗鵝觀草(麥秀林場)>短柄鵝觀草(澤庫)>毛穗鵝觀草(澤庫)。不同海拔分布的同一植物種的抗寒性也有一定差異，體現(xiàn)出了環(huán)境對植物的塑造性。海拔高的地區(qū)年均氣溫較低，在寒冷地區(qū)生長的植物抗寒性較強一些。有研究表明[29-31]，與氣候梯度有關(guān)的基因梯度的分布說明寒冷地區(qū)的樹種更為抗寒。與此類似，分布地海拔較高的瑪多縣的玉樹鵝觀草較分布地海拔較低的鐵卜加的玉樹鵝觀草的抗寒性強。本研究設(shè)置的溫度范圍為-25～5 ℃。檢索對高原植物低溫脅迫的研究文獻，發(fā)現(xiàn)已有研究中設(shè)置的溫度偏高，缺乏-25～-15 ℃的低溫設(shè)置，所以本研究可對比的文獻不多。

表2 供試鵝觀草材料苗期葉片抗寒性各指標(biāo)隸屬函數(shù)值、權(quán)重及評價值Table 2 Synthetic evaluation indexes and weighted value of cold resistance character of 10 Roegneria germplasm

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