叢枝菌根真菌和磷對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗生長與生理特征的影響

林子然，張英俊(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100094)

隨著溫室效應(yīng)的日益加劇，氣候持續(xù)變暖，全球性干旱現(xiàn)象愈加嚴(yán)峻。世界上超過1/3的土地，尤其是42.9%的耕地處于干旱或半干旱的狀態(tài)[1]。水分是影響作物生產(chǎn)的首要因素[2]，干旱嚴(yán)重限制植物的生長發(fā)育，致使作物大面積減產(chǎn)，對牧草生產(chǎn)和畜牧業(yè)發(fā)展帶來極嚴(yán)重?fù)p失。紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種優(yōu)質(zhì)的豆科牧草，有著生物量高、品質(zhì)好、 家畜喜食等特點(diǎn)。但干旱會嚴(yán)重影響紫花苜蓿的質(zhì)量和產(chǎn)量[3-4]。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi，AMF)是一種自然界中存在廣泛的共生微生物。AMF侵染植物根部后會形成致密的菌絲網(wǎng)，增大與土壤接觸面積，可從土壤中吸收更多更深層的水分[5-6]，進(jìn)而提高宿主植物的抗旱能力。前人對紫花苜蓿[7]、小麥(Triticumaestivum)[8]等的研究表明，與未接種叢枝菌根真菌的植株相比，接種AMF對植物的株高、根系生長、營養(yǎng)物質(zhì)的累積、光合效應(yīng)等方面都有顯著的提高。而對大豆(Glycinemax)等豆科植物，具有減緩干旱協(xié)迫下生物量減少的趨勢，并顯著的緩解干旱對大豆的氧化損傷[9]。叢枝菌根真菌同時可以促進(jìn)植物對土壤中磷元素吸收和利用[10]，而不同的磷濃度對菌根侵染率有一定的影響，從而對AMF抗旱性產(chǎn)生影響[11]。但是AMF對于牧草抗旱性的研究較少，而且接種叢植菌根真菌在不同磷濃度下改善水分脅迫作用的三因素試驗(yàn)，以及他們之間的互作效應(yīng)尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。

本研究以紫花苜蓿品種WL 168 HQ為試驗(yàn)材料，探究水、磷、叢枝菌根真菌對于紫花苜蓿抗旱性能的影響，旨為紫花苜蓿抗旱性評價和充分利用叢枝菌根真菌促進(jìn)苜蓿生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫花苜蓿種子WL168HQ購于北京正道生態(tài)科技有限公司，秋眠級2，適用于放牧及干草生產(chǎn)。接種摩西球囊霉菌(Glomusmosseae)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院提供。10 g沙土樣品菌劑孢子數(shù)平均為216個。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院溫室進(jìn)行，溫室的溫度變化范圍為28～38 ℃。試驗(yàn)采取三因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)水分處理：充足水分(W1，田間持水量75%～80%)、輕度干旱(W2，田間持水量55%～60%)、中度干旱(W3，田間持水量35%～40%)、重度干旱(W4，田間持水量15%～20%)；磷施加量濃度：P1，無磷Hogland營養(yǎng)液；P2，0.25 mmol·L-1KH2PO4Hogland營養(yǎng)液；P3，0.5 mmol·L-1KH2PO4Hogland營養(yǎng)液；以及是否接種AMF。共24個處理，每個處理4個重復(fù)，共計(jì)96盆。

試驗(yàn)開始前，每盆(花盆上口徑19 cm，下口徑14.5 cm，高18 cm)裝未施肥低磷土壤(pH 6.9)，過2 mm篩后按河沙與土1∶1(質(zhì)量比)混勻，培養(yǎng)土基本養(yǎng)分狀況：全氮0.7 g·kg-1，速效磷5.4 mg·kg-1，全鉀12.3 mg·kg-1。所有培養(yǎng)基質(zhì)均在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能所用γ射線(25 kGy)滅菌處理，裝土前將苗、盆用無水乙醇消毒，每盆裝入3.5 kg培養(yǎng)土。一半盆栽中加入20 g摩西球囊霉菌，另一半加入等量γ射線滅菌菌劑。于5月18日播種，每盆點(diǎn)播40粒種子，于5月31號間苗，每盆留15株長勢均一的苜蓿幼苗以備試驗(yàn)測定。植株正常生長25 d后進(jìn)行干旱脅迫，采用稱重法控制水分。在試驗(yàn)的第1、15、30天時分別將P1：無磷Hogland營養(yǎng)液、P2： 0.25 mmol·L-1KH2PO4Hogland營養(yǎng)液、P3：0.5 mmol·L-1KH2PO4Hogland營養(yǎng)液施加在不同植株中，每次施加150 mL。在脅迫25 d時對株高和土壤含水量進(jìn)行測量，并分別剪取葉片，將其放于冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，并儲藏于-80 ℃冰箱中，用于測定葉片含水量、丙二醛等生理指標(biāo)，剩余5株幼苗整株取樣，65 ℃烘干24 h,用于測定生物量。從每個盆栽中取出10條完整的根，先用自來水清洗干凈，再用去離子水多次沖洗，最后用吸水紙將多余水分去除，選取新鮮根系進(jìn)行測定菌根侵染率。

1.3 指標(biāo)測定

紫花苜蓿的株高采用卷尺測量基部到植株最高部位的自然距離；葉片相對含水量采用烘干稱量法測定；根莖比(root/shoot)為地下生物量和地上生物量的比值，菌根侵染率采用臺盼藍(lán)染色法測定[12]，光合指標(biāo)用Li-6400進(jìn)行測定，超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定[13]，脯氨酸(Pro)采用茚三酮法測定[14]，丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法測定[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，對植物的抗干旱脅迫能力的測定采用t檢驗(yàn)，其余指標(biāo)采用One-Way ANOVA進(jìn)行方差分析。不同處理間的交互作用及影響采用一般線性模型進(jìn)行分析，用Ducan法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對株高的影響

結(jié)果表明，隨著水分脅迫的加劇，無論是否接種AMF，紫花苜蓿的株高均顯著下降(P<0.05)。在W1、W2的水分條件下株高顯著高于在W3、W4的水分條件下的株高(P<0.05)。在W1和W2處理組，接種AMF的紫花苜蓿株高均顯著(P<0.05)高于未接種AMF(圖1)。在未接種AMF的W1處理下，P3處理組的株高均顯著高于P2；隨著水分的降低，這種差異逐漸減小，各個磷處理間差異不顯著；且在W1條件下，高濃度磷處理會顯著提高株高。而在接種AMF的條件下，磷濃度對植株高度無顯著影響。據(jù)此推測,植株高度對不同水分、AMF、磷條件響應(yīng)不同。

圖1 不同水分、磷濃度下接種菌根真菌后紫花苜蓿株高Fig. 1 Plant height of alfalfa under different water and phosphorus concentrations and inoculation of mycorrhizal fungi

W:不同程度干旱脅迫處理；W-A:不同程度干旱脅迫+接種AMF處理；W-P2:不同程度干旱脅迫+P2濃度磷處理；W-P3:不同程度干旱脅迫+P3濃度磷處理；W-P2-A:不同程度干旱脅迫+P2濃度磷+接種AMF處理；W-P3-A:不同程度干旱脅迫+P3濃度磷+接種AMF處理。不同小寫字母表示不同干旱協(xié)迫處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

W: different degrees of drought stress; W-A: different degrees of drought stress+AMF inoculation; W-P2: different degrees of drought stress+P2concentration of phosphorus treatment; W-P3: different degrees of drought stress+P3concentration of phosphorus treatment; W-P2-A: different degrees of drought stress+P2concentration of phosphorus+AMF treatment; W-P3-A: different degree of drought stress+P3concentration of phosphorus+AMF inoculation. Different lowercase letters mean significant difference among different water treatments at the 0.05 level; similarly for the following figures.

2.2 不同處理對植株菌根侵染率的影響

在各個水分梯度下，施加P2和P3處理組菌根侵染率顯著高于無磷處理組(P<0.05)。而在W1、W2的水分梯度下，施磷后植株菌根侵染率顯著高于W3、W4水分梯度(圖2)。由此可知，施加磷處理會顯著提高對植株的菌根侵染率。

2.3 不同處理對生物量的影響

不同干旱脅迫對生物量的影響不顯著(P>0.05)。在相同干旱脅迫條件下，不同濃度磷處理在對紫花苜蓿地上生物量和地下生物量影響不顯著(P>0.05)。在磷濃度相同時，紫花苜蓿的地上生物量隨水分的降低而降低。接種AMF在W1和W2時地上地下生物量明顯高于未接種AMF組，在W3和W4時地上生物量變化與未接種AMF相比差異不顯著。而不同處理對地下生物量未產(chǎn)生顯著影響。

2.4 不同處理對葉片相對含水量的影響

相對含水量是干旱條件下細(xì)胞脫水的一個重要指標(biāo)。隨著干旱脅迫程度的加劇，各處理組葉片的相對含水量均顯著下降(P<0.05)。而各處理組中，無論是否接種AMF，磷濃度的變化對葉片相對含水量未產(chǎn)生顯著影響。W3條件下接種AMF，可以顯著的增加葉片的相對含水量(P<0.05)，且提高在低水分處理下的葉片持水能力；當(dāng)水分脅迫加劇時，磷的添加和AMF侵染可以有效地增加苜蓿葉片中相對含水量。施加P2并接種AMF相對于同水平上未接種AMF相對水分含量增加了73.08%。

2.5 紫花苜蓿相關(guān)生理指標(biāo)

2.5.1不同處理對葉片MDA含量的影響 隨著干旱脅迫程度的加劇，紫花苜蓿葉片中MDA含量呈增加趨勢，且在W4時達(dá)到最大值(圖5)。而不同磷濃度在輕度干旱狀況下(W3)對紫花苜蓿MDA含量有一定抑制作用(P<0.05)，而在其他處理組中影響不顯著(P>0.05)。在相同水分條件下添加AMF后對比未添加AMF處理組，MDA變化不顯著(P>0.05)。

圖2 不同水分、磷濃度下接種菌根真菌后紫花苜蓿菌根侵染率Fig. 2 Alfalfa mycorrhiza infection rate under different water & phosphorus concentrations and inoculation of mycorrhizal fungi

2.5.2不同處理對葉片SOD活性的影響 隨著水分脅迫的增加，SOD活性顯著下降(P<0.05)(圖6)。但在W2、W3水分梯度條件下，添加AMF后SOD的活性都顯著高于未添加AMF的處理(P<0.05)。而在P3條件處理下，植株內(nèi)SOD活性相較于P2處理組顯著下降(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

3.1 干旱脅迫下不同磷濃度及AMF侵染對紫花苜蓿生長的影響

干旱脅迫會導(dǎo)致幼苗發(fā)育緩慢。本研究中，低于正常水分條件下生長的幼苗長度均被抑制，且抑制作用隨著干旱脅迫的加劇而顯著增強(qiáng)。接種AM真菌后可以顯著地減緩紫花苜蓿因水分脅迫導(dǎo)致株高降低趨勢，這與于潔等[16]的研究結(jié)論一致。而與未施加磷的對照組相比，接種AMF且施加0.25 mmol·L-1KH2PO4處理組株高和地上生物量顯著增加，說明接種AMF可以有效緩解干旱對紫花苜蓿生長的抑制作用。在接種AMF且0.5 mmol·L-1KH2PO4營養(yǎng)液處理下，株高增加顯著。這可能是由于磷參與了植株的光合作用，施加磷最利于葉綠體合成光合作用產(chǎn)物，進(jìn)而促進(jìn)了植株高度的增加；但與0.25 mmol·L-1KH2PO4組對比株高增加不顯著，且地上生物量增長亦不顯著。因此,無法證明這兩個梯度磷水平可以改善植株的抗旱性能。而高濃度磷添加的營養(yǎng)液并未顯著提高植株的菌根侵染率，甚至還有所下降，這可能是由于在高磷條件下，隨著寄主植物磷營狀況的改善，菌根真菌的菌絲生長受到抑制，因而降低了菌根侵染率[17]。研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下，在所有磷濃度處理?xiàng)l件下施用AMF均可以增加紫花苜蓿的地上生物量，提高植株的持水能力，使紫花苜蓿能在水分虧缺條件下維持生長。這與石偉琦等[18]施用AMF促進(jìn)紫花苜蓿生物量的結(jié)論相一致，而與李重祥[19]在紫花苜蓿上的研究不完全一致，可能是因?yàn)檫x用不同菌種與不同寄主植物的親和效應(yīng)不同，從而產(chǎn)生了不同的試驗(yàn)結(jié)果。

圖3 不同水分、不同磷濃度條件下接種菌根真菌后紫花苜蓿生物量Fig. 3 Alfalfa biomass under different moisture & phosphorus concentrations after inoculation of mycorrhizal fungi

圖4 不同水分、不同磷濃度下接種菌根真菌后紫花苜蓿葉片相對含水量Fig. 4 Relative water content of alfalfa leaves under different moisture & phosphorus concentrations after inoculation of mycorrhizal fungi

圖5 不同水分、不同磷濃度條件下接種菌根真菌后紫花苜蓿體內(nèi)MDA含量Fig. 5 MDA content in alfalfa under different water & phosphorus concentrations and inoculation of mycorrhizal fungi

圖6 不同水分、不同磷濃度下接種菌根真菌對紫花苜蓿體內(nèi)SOD活性量的影響Fig. 6 SOD activity in alfalfa under different water & phosphorus concentrations and inoculation of mycorrhizal fungi

3.2 干旱脅迫下不同磷濃度及AMF侵染對紫花苜蓿相關(guān)生理指標(biāo)的影響

葉片相對含水量是反映植物水分狀況的重要生理指標(biāo)。在干旱脅迫條件下，接種叢枝菌根真菌顯著地提高了葉片中的相對含水量，因?yàn)锳MF在根系周圍形成的菌絲體網(wǎng)絡(luò)可以幫助植物從更深的土層、更小的土壤縫隙中汲取更多的水分，菌絲體網(wǎng)絡(luò)也增大了根系與土壤的接觸面積[20]。本研究得出紫花苜蓿葉片中相對水分含量的改變，主要是通過水、磷和AMF三者間的互作進(jìn)行調(diào)控；水分條件較好(W1、W2)，接種AMF，且施0.5 mmol·L-1KH2PO4營養(yǎng)液時，植株葉片持水能力較強(qiáng)，結(jié)合前人研究表明,施入磷肥有利于水分的吸收利用[21]。而當(dāng)水分脅迫增加時(W3、W4)，菌根的形成受到水分不足和磷濃度過高的抑制，可能影響菌絲活性，在深度干旱條件下也影響了植株根系的生長。隨著水分的不斷減少，植物產(chǎn)生MDA等有害物質(zhì)逐漸增多，MDA可作為植物膜損傷的主要指標(biāo)，用以鑒別植物抗逆性的強(qiáng)弱。本研究中，丙二醛含量隨著干旱脅迫增強(qiáng)升高，這與前人的研究結(jié)論相一致[15]，說明干旱對植物具有較強(qiáng)的損傷作用，使細(xì)胞膜破損，細(xì)胞液外滲，影響紫花苜蓿正常的生長以及組織器官進(jìn)行正常的生理反應(yīng)；接種AMF的處理組產(chǎn)生的MDA含量則顯著下降，這與前人的研究[22-24]結(jié)果一致，證明接種AMF菌種可以通過提高植株內(nèi)抗氧化酶活性的方式來共同適應(yīng)干旱脅迫，對維持植株正常生長及抗性生長具有重要生態(tài)學(xué)意義。在水分條件較好的處理組中，0.25 mmol·L-1KH2PO4水平下MDA含量高于無磷施入和0.5 mmol·L-1KH2PO4水平，而在中度和重度干旱脅迫條件下，施入磷濃度越高M(jìn)DA含量則相對越低，說明在中度至重度干旱時施入磷肥可以降低有害物質(zhì)的產(chǎn)生。SOD是一種能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)的酶類物質(zhì)，當(dāng)遭遇水分脅迫時，SOD的活性顯著降低[25-26]。在本研究中，在一定水分條件下(W2)接種AMF顯著提高了紫花苜蓿植株內(nèi)SOD活性；且在相同水分條件下，無論處理組是否接種AMF，隨著施磷量的增加SOD活性呈現(xiàn)下降趨勢。這與趙平娟等[27]的研究結(jié)果不盡相同，AMF的接種并未在干旱狀態(tài)下通過改善SOD酶活性的方式以延緩植株受傷害的速度,這可能是由于不同品種對于AMF的響應(yīng)不同，對不同品種酶活性刺激產(chǎn)生差異。

3.3 干旱脅迫、不同磷濃度和AMF的互作機(jī)理

干旱脅迫隨著環(huán)境狀況的日益惡劣，已經(jīng)作為對植物生長狀態(tài)威脅最大的自然因素被人們廣泛關(guān)注，目前已有眾多研究人員對提高植株的抗性能力進(jìn)行了研究。但目前研究較多的是單一改善條件處理對不同種類植株的抗性影響，對于多種條件聯(lián)合處理植株的抗性改善作用還不太明了。從理論上講，聯(lián)合施用相對于單一施用具有更好的改善抗性作用，但也不排除可能存在拮抗作用的情況。

本研究分別以3種條件且分為不同的濃度分別進(jìn)行處理，結(jié)果表明在特定的干旱脅迫條件下(W2)，同時施加適量磷并接種AMF聯(lián)合處理對植株株高的影響相較于相同干旱脅迫條件下的單獨(dú)處理顯著增強(qiáng)；而在干旱嚴(yán)重的條件下(W3、W4)，同時施加適量磷并接種AMF聯(lián)合處理對植株葉片含水量的影響相較于相同干旱脅迫條件下的單獨(dú)處理顯著增強(qiáng)，提高了植株的持水能力，有助于植株抗旱；而在一定的干旱的條件下(W3)，同時施加適量磷并接種AMF聯(lián)合處理相較于單一處理，減少了植株內(nèi)的MDA含量，但在重度干旱條件下(W4)影響不顯著；而高磷濃度與接種AMF甚至抑制了植株SOD活性，這可能與磷濃度過高，使得植株內(nèi)部抗氧化酶活性受到影響，導(dǎo)致氧化脅迫的進(jìn)一步加劇有關(guān)[28]。也可能是由于在菌根共生結(jié)構(gòu)中，宿主植物紫花苜蓿在為AMF提供碳源的同時，也從菌根共生體中獲得了N、P等營養(yǎng)元素，因而造成了對試驗(yàn)結(jié)果的影響[29]。而干旱同時也影響了AMF菌絲在根系上的定植，AMF與植株內(nèi)生真菌和其他微生物之間可能產(chǎn)生的互作效應(yīng)[30]以及試驗(yàn)過程不同區(qū)域光照強(qiáng)度可能出現(xiàn)的偏差，均可能使得不同植株之間的生長出現(xiàn)不同程度影響。此外，AMF、適宜磷濃度聯(lián)合處理在適宜的水分條件下比任一單獨(dú)處理及兩兩聯(lián)合作用產(chǎn)生的效果更優(yōu)，雖然聯(lián)合處理比單獨(dú)處理植株的抗性更好但其不存在交互作用，說明在適宜的水分及適宜的磷濃度下這3種條件聯(lián)合處理僅存在累加作用；而AMF與較高濃度磷之間存在交互作用且聯(lián)合作用和單獨(dú)處理相比沒有明顯差別甚至有所抑制。說明AMF與高濃度的磷水平間可能存在拮抗作用。

綜上所述，在紫花苜蓿植株中接種AMF及施加磷營養(yǎng)液可以從生長、生理生化指標(biāo)等多方面顯著的改善植株的抗旱能力，緩解因水分脅迫對植株造成的損傷。其中，在添加正常磷濃度Hogland(0.25 mmol·L-1KH2PO4)營養(yǎng)液的條件下，接種AMF對紫花苜蓿干旱脅迫的改善效果最為顯著。

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