基于胰腺癌患者來源異種移植模型的化療藥物篩選

張賀，陳薛，張彩勤，趙勇，譚鄧旭，師長宏*

(1. 第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，西安 710032； 2. 原沈陽軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)務部，沈陽 110015)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

胰腺癌是一種惡性程度很高的消化系統腫瘤[1]，根據美國癌癥協會(American Cancer Society, ACS)統計，胰腺癌死亡率位列癌癥相關死亡率第4位[2-3]，在我國位列惡性腫瘤發(fā)病率第7位[4]。胰腺癌患者確診時多為晚期，臨床療效十分有限，5年生存率低至6%，約20%的患者有手術機會，術后5年生存率僅為25%[1]。因此提高胰腺癌臨床治療并篩選出適合的個體化治療藥物至關重要。

隨著腫瘤生物學的發(fā)展，越來越多的新技術應用于腫瘤研究。人源異種移植技術(patient-derived xenograft，PDX)應用于腫瘤生物學研究，使得人們對腫瘤的特性有了更進一步的了解。利用免疫缺陷小鼠，建立腫瘤PDX模型能夠很好地保持患者腫瘤的遺傳特性和異質性[5]。有研究證實PDX模型保持了原發(fā)腫瘤的病理學特征和生物學特性，臨床一致性高，具有靶向性藥物篩選的獨特優(yōu)勢。PDX模型的藥物篩選結果可以指導臨床用藥[6]，避免了無效化療藥物對患者的毒副作用，節(jié)省患者的時間和費用，為腫瘤個體化治療的提供了新思路[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

30只SPF級雄性裸鼠，6～7周齡，體重22～25 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供【SCXK(蘇)2016-0010】。飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心SPF級屏障設施中【SYXK(陜)2014-001】。環(huán)境溫度23～25℃，相對濕度40%，12 h晝夜交替，飼料經輻照處理，飲用水經高壓滅菌處理，動物自由攝食和飲水。

1.1.2 倫理審查及腫瘤標本

本研究動物實驗通過了第四軍醫(yī)大學實驗動物福利及倫理委員會批準(編號：14013)。胰腺癌腫瘤標本(編號：D64310)來自第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院消化病醫(yī)院，腫瘤標本的取得經過患者本人及家屬同意，并簽署知情同意書，僅供實驗研究。人體標本實驗均通過西京醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準(批準編號：2015432)。

1.1.3 試劑及藥物

基質膠由美國BD公司生產，DMSO購自Sigma公司，胎牛血清由浙江天杭生物科技股份有限公司生產，蘇木精和伊紅染色液購自北京雷根(Leagene)生物技術有限公司，組織基因組DNA提取試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司生產。臨床三種注射用化療藥物鹽酸吉西他濱(商品名稱：健擇Gemzar)、奧沙利鉑和鹽酸伊立替康注射液(商品名稱：開普拓/CAMPTO) 分別購自美國Eli Lilly and Company公司、中國齊魯制藥(海南)有限公司和Pfizer(Perth)Pty Limited Technology Park公司。

1.2 方法

1.2.1 PDX模型的建立和腫瘤組織溯源性檢測

將患者新鮮的腫瘤組織(命名為P0代)剪碎為3 mm3，混合適量的基質膠，利用穿刺針移植到裸鼠背部皮下，命名為P1代，成瘤后生長至800 mm3～1 000 mm3時，異氟烷麻醉小鼠，手術獲取腫瘤組織，在另一只裸鼠皮下進行傳代，命名為P2代，以此類推。凍存腫瘤組織(凍存液成分為：10% DMSO + 90%胎牛血清)。取P3代瘤組織，利用試劑盒提取基因組DNA，送西京醫(yī)院司法鑒定中心進行STR基因分型檢測。

1.2.2 實驗分組及藥物治療

將P3代腫瘤剪成1 mm3組織塊，分別接種于30只裸鼠皮下。待瘤組織長至100 mm3～150 mm3時，隨機分為四組(n=5)：對照組(control)、鹽酸吉西他濱治療組(gemcitabine)、奧沙利鉑治療組(oxaliplatin)和鹽酸伊立替康治療組(irinotecan)。藥物濃度、給藥方式和給藥頻率，見表1。利用游標卡尺測量腫瘤體積，分別測量皮下腫瘤的長度(l)和寬度(w)，腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2 ×(w2×l)。

奧沙利鉑治療組，藥物濃度為5 mg/kg，每周注射3次；鹽酸吉西他濱治療組，藥物濃度為50 mg/kg，每周注射2次；鹽酸伊立替康治療組，藥物濃度為100 mg/kg，每周注射1次；均為腹腔注射。

1.2.3 藥物療效的評價

治療開始后每周測量腫瘤體積兩次，當瘤體積達到1000 m3或飼養(yǎng)天數達到48 d，無論哪個數據先到即終止該組實驗。根據文獻[8]提供的方法，建立TGD值數學模型。

TGD=T -C

采用TGD(tumor growth delay)值評價治療效果[8]，T表示某治療組TTE值的中位數，C表示對照組TTE值的中位數，均以d為單位，TGD值與對照組差異呈正相關。TTE值(time to endpoint)表示達到治療終點的時間，以d為單位；endpoint volume表示到達治療終點時的腫瘤體積，以mm3為單位；取每一個測量時間點的腫瘤體積對數，并繪制線性關系曲線，m為斜率，b為截距，橫坐標為實驗進展天數，縱坐標為腫瘤體積對數。將endpoint volume代入公式，本實驗endpoint volume為1000 mm3，計算TTE值。任何沒有達到終點體積1000 mm3的實驗對象，TTE值以實驗整體結束時間為準。如果出現治療相關的動物死亡，如藥物毒性作用，該動物的TTE值以死亡時間計算；如果出現非治療相關動物死亡，如飲食或環(huán)境因素等，不予計算該動物的TTE值。

1.2.4 腫瘤組織的形態(tài)學觀察

取腫瘤組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.2.5 血漿中CA19-9的檢測

治療結束后，各組PDX模型心臟采血，5000 r/min 離心10 min，分離上層血漿，送西京醫(yī)院檢驗科檢測CA19-9含量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 PDX模型腫瘤的生長曲線

根據PDX模型腫瘤生長情況，連續(xù)測定腫瘤體積，繪制標本D64310移植瘤的生長曲線，見圖1。生長曲線顯示腫瘤呈現指數生長趨勢，符合腫瘤生長的特點。

2.2 腫瘤組織溯源性STR檢測

STR檢測顯示檢測所用的十六個基因座均檢測到信號，見圖2。表明經過傳代后，P3代腫瘤組織與患者術后P0代腫瘤組織同源性為99.99%。

2.3 腫瘤組織形態(tài)學觀察

瘤組織HE染色后，對比原發(fā)瘤與裸鼠不同代瘤組織形態(tài)，結果見圖3，腫瘤組織腺體生長豐富，腫瘤細胞處于增值旺盛階段，原發(fā)瘤(P0代)組織形態(tài)與裸鼠P1代、P2代和P3代移植瘤無明顯差異。

圖1 PDX模型生長曲線Fig.1 Growth curve of PDX model

2.4 療效評價及藥物篩選

藥物的治療效果通過腫瘤體積的變化進行評價。根據實驗動物福利及倫理要求，當腫瘤體積過大，影響動物正常的生理活動時，應停止實驗。同時，腫瘤體積和重量呈正相關，隨著腫瘤體積的增加，其重量占裸鼠體重的比例也越高，通過體重評價藥物毒性作用的可行性就越低。本研究項目中腫瘤體積達到1000 mm3時，終止該組實驗。腫瘤體積的變化趨勢見圖4a。

各實驗組腫瘤體積變化趨勢用中位數表示。如圖所示，對照組腫瘤體積增長最明顯，呈指數生長趨勢，在第20天左右時，體積達到1000 mm3，即終止實驗；奧沙利鉑治療組腫瘤體積增大趨勢僅次于對照組，在第32天測量腫瘤體積時，達到1000 mm3，終止實驗；鹽酸伊立替康治療組治療開始時腫瘤體積增大趨勢明顯，在第20天以后，變化趨勢較為平緩，體積基本穩(wěn)定在500 mm3左右，到達第48天時終止實驗；鹽酸吉西他濱治療組腫瘤呈減小的趨勢，腫瘤體積變化趨勢很平穩(wěn)，體積一直維持在200 mm3之內，到達第48天時終止實驗。

采用TGD值數學模型法來評價臨床化治療效果，確定藥物篩選結果，見表1。

表1 治療效果評價表Tab.1 Evaluation of the therapeutic effects

注：鹽酸吉西他濱治療組、鹽酸伊立替康治療組分別與對照組相比差異有顯著性，**P<0.01。

Note. Gemcitabine and Irinotecan compared with control respectively,**P<0.01.

圖2 STR檢測結果Fig.2 Results of STR detection

圖3 腫瘤組織各代HE染色結果(bar=20 μm)Fig.3 Histology of tumor samples from different passages(HE staining,bar=20 μm)

對照組TTE值最小，表明該組達到腫瘤體積終點用時最短，奧沙利鉑治療組次之，鹽酸伊立替康治療組和鹽酸吉西他濱治療組理論上達到腫瘤體積終點用時很長或不會達到腫瘤體積終點，采用實驗終點時間作為TTE值；對照組m值最大，奧沙利鉑治療組次之，鹽酸伊立替康治療組m值為正數最小，三組腫瘤體積呈增長趨勢，鹽酸吉西他濱治療組m值為負數，表明該組腫瘤體積呈減小趨勢。鹽酸伊立替康治療組和鹽酸吉西他濱治療組兩組TGD值最大，奧沙利鉑治療組最小。采用獨立樣本t檢驗方法對比治療組和對照組，鹽酸伊立替康治療組和鹽酸吉西他濱治療組兩組P=0.001，差異有顯著性。

2.5 藥物毒性評價結果

通過對裸鼠體重和狀態(tài)的觀察，進行藥物毒性評價。當裸鼠體重下降高于本身體重的20%時，藥物累計劑量為裸鼠的最大耐受劑量(maximum tolerated dose，MTD)，此時停止治療。待體重恢復時繼續(xù)治療，停藥時裸鼠的體重和腫瘤體積連續(xù)稱量。裸鼠體重變化結果，見圖4b。

如圖所示，對照組體重略有下降趨勢，但不顯著；奧沙利鉑治療組體重下降最為明顯，而且幅度最大，在實驗第15天左右出現最低值，然后體重逐步回升，說明藥物對體重影響最大，藥物毒性強；鹽酸吉西他濱治療組裸鼠體重下降較明顯，在第11天左右出現最低值，略高于奧沙利鉑治療組最低值，而后逐步回升并穩(wěn)定在20 g以上，表明鹽酸吉西他濱治療組藥物毒性小于奧沙利鉑治療組；鹽酸伊立替康治療組裸鼠體重下降最為緩慢，在第28天左右出現最低值，而且高于奧沙利鉑治療組和鹽酸吉西他濱治療組體重最低值，而后逐步回升穩(wěn)定在20 g以上，該組藥物對體重影響最小，表明藥物毒性最小。

2.6 血漿中CA19-9的檢測結果

血漿CA19-9含量是胰腺癌臨床診斷的重要指標，見圖4c。在實驗中可以作為治療效果和靶向藥物篩選的輔助評價指標。

鹽酸吉西他濱治療組血漿CA19-9含量最低，平均含量為9.1 U/mL，鹽酸伊立替康治療組平均含量為154 U/mL，奧沙利鉑治療組平均含量為172.9 U/mL，對照組最高，平均含量為198.35 U/mL。

2.7 各實驗組組織形態(tài)學觀察

注：a. 腫瘤體積變化趨勢, b. 治療過程體重變化趨勢，c.血漿CA19-9含量。圖4 PDX模型療效及毒性評價Note. a. Variation tendency of tumor volume. b. Body weight during the treatment. c. Content of plasma CA19-9.Fig.4 Assessment of therapeutic effect and toxicity for the PDX models

各實驗組瘤組織HE染色結果，見圖5。對照組腫瘤組織導管樣腺腔豐富，癌細胞活躍；奧沙利鉑治療組腺腔減少，但是仍可見活躍癌細胞；鹽酸伊立替康治療組大部分腺腔消失，正常組織細胞替代癌細胞；鹽酸吉西他濱治療組腫瘤組織特征已經不明顯，趨于正常。

圖5 各組治療后的組織學改變 HE染色(bar=100 μm)Fig.5 Histological changes of the xenograft tissues after chemotherapy(HE staining)

3 討論

PDX模型較好的保持了原發(fā)性瘤中大多數的關鍵基因和信號通路活性[6,9]，能夠更好的模擬腫瘤患者親本基因學特征[10]，而且不同腫瘤患者來源的PDX模型其生物學和遺傳學特性會有所不同，對單一模型有效的靶向藥物，不適用于來源不同的其他模型[11]。這些特征恰好滿足靶向藥物篩選和個體化治療的要求，為不同腫瘤患者篩選出適合的藥物，提供優(yōu)化的治療方案，克服腫瘤多藥耐藥等問題。因此，PDX模型應用于腫瘤生物學實驗具有獨特優(yōu)勢[12]。目前，美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute，NCI)針對基因改變這一腫瘤發(fā)生發(fā)展的核心內容，在腫瘤的靶向治療中，開發(fā)了一種新的臨床實驗，稱為“NCI-MATCH”(NCI-Molecular Analysis for Therapy Choice)[13]，同時進行新型抗腫瘤藥物的研發(fā)方面。該實驗的特點是利用PDX模型，針對不同靶點給予針對性的靶向藥物，實驗分組和靶點的選擇是通過基因測序來完成的，而不是按照傳統的癌癥病種和部位劃分。這種基因水平的分組方式，不僅是個體化醫(yī)療和精準醫(yī)療的體現，也是一種共性研究，它打破了以往傳統的分類界限，從不同的癌種中提取出了共性的基因學特征，更有利于靶向治療的開展。

利用PDX模型進行臨床化治療和靶向藥物篩選時，需要解決三個關鍵問題。①選擇穩(wěn)定傳代的PDX模型[14]。建立P1代的PDX模型尚不能應用于實驗研究，人源腫瘤的異體生長狀態(tài)不穩(wěn)定，應選擇生長狀態(tài)穩(wěn)定的P3-P8代模型進行實驗研究[15]。②傳代后PDX模型的溯源性評價[16]。人源腫瘤組織在裸鼠皮下進行生長，理論上腫瘤細胞具有無限增值的潛能，但是隨著裸鼠體內傳代次數的增加，鼠源成分會逐漸替代人源成分。有研究表明[17]，不同種類的腫瘤PDX模型被鼠源成分替代的速率是不相同的，一般認為經過8～10次傳代以后，腫瘤組織的人源性不能保證。因此，對實驗中腫瘤組織進行溯源性檢測十分必要。STR(short tandem repeat)基因座檢測被稱作第二代DNA指紋技術，并已廣泛用于遺傳制圖、連鎖分析、親子鑒定、個體識別、疾病基因定位和物種多態(tài)性研究等領域[18]，是腫瘤組織溯源性重要的評價指標。③治療效果的評價。常用腫瘤體積的變化來判定藥物療效，在測量腫瘤體積時同一個腫瘤不同的研究人員測量會出現不同的結果，人為系統誤差太大。本研究建立TGD值數學模型的方法[8]，最大限度的減小了系統誤差，對每一個實驗樣本建立數學模型，準確模擬出腫瘤生長情況，同時輔助以血漿CA19-9含量檢測和組織形態(tài)學觀察，綜合評價治療效果。

TGD值數學模型能夠準確模擬出每一個實驗對象腫瘤生長情況，通過m值可以準確判斷腫瘤的生長趨勢，值越大表明腫瘤生長速度越快，若m值為負數，表明腫瘤體積呈減小趨勢；TGD值表示治療組比對照組達到腫瘤終點體積的延后時間，值越大表明與對照組差異越大，說明治療效果越好。本研究通過腫瘤體積變化趨勢表和TGD值療效評價表可以看出，無藥物干預的對照組m值最大，腫瘤增長趨勢最為明顯，奧沙利鉑治療組次之，m值略小于對照組，腫瘤體積增長趨勢較為明顯，TGD值與對照組相比差異性不顯著(P=0.05)，表明奧沙利鉑治療組對于該腫瘤抑瘤效果不明顯；鹽酸伊立替康治療組m值略小于奧沙利鉑治療組，腫瘤體積呈現小幅增長趨勢，從體積變化趨勢看出，治療中后期，該組腫瘤體積呈現平穩(wěn)趨勢，藥物起效時間較晚，但抑瘤效果明顯，TGD值與對照組相比差異極顯著(P=0.001)，表明藥物作用效果持久，能夠抑制腫瘤生長；鹽酸吉西他濱治療組m值為負數，表明腫瘤體積呈現減小趨勢，而且體積始終控制在一定的范圍內，沒有較大的波動，TGD值與對照組相比差異極顯著(P=0.001)，表明該組藥物作用最為明顯，抑瘤效果最好。輔助血漿CA19-9含量檢測，鹽酸吉西他濱治療組含量最低，表明腫瘤細胞分泌CA19-9的能力最弱，胰腺癌特征已經不明顯，治療效果最優(yōu)，靶向性最好。通過組織形態(tài)學觀察也可以看出，鹽酸吉西他濱治療組腫瘤特征已不明顯，導管樣腺體結構較少，細胞形態(tài)呈現正?；?，并有轉歸趨勢。通過體重變化趨勢評價藥物毒性，鹽酸伊立替康治療組藥物毒性作用最小，對裸鼠體重影響最小，鹽酸吉西他濱治療組次之，而且在治療中后期，各組裸鼠體重上升，對照腫瘤體積變化趨勢圖，表明藥物的療效不是通過犧牲體重達到的。

綜合以上各類因素，推薦吉西他濱作為D64310患者的首選化療藥物，考慮體重下降過快、明顯消瘦等強烈藥物毒性反應，可以選擇伊立替康進行維持治療。通過對該患者來源的腫瘤組織建立PDX模型進行藥物篩選，能夠得出指導臨床實際用藥的結果，為腫瘤的臨床治療提供了有效的個體化方案。

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