UPLC-PDA法測定楊樹花口服液中非法添加物黃芩苷

魏秀麗，張傳津，李有志

(山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南250022)

近年來，獸藥監(jiān)管部門針對一些不法企業(yè)在中獸藥中非法添加化學(xué)藥品，組織開展了系列中獸藥中非法添加物檢測方法的研究，對開展非法添加物的篩查、確證工作提供了科學(xué)準(zhǔn)確的檢測依據(jù)，有力打擊了非法造假行為，已取得了初步成效；但是現(xiàn)在市場又出現(xiàn)了一種新的極其隱蔽的獸藥造假行為：一些不法企業(yè)為了提高療效，私自調(diào)整中藥處方，在原中藥處方中添加處方外的中藥成分，對動(dòng)物安全同樣帶來潛在危害。山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所承擔(dān)了山東省和部分外省的非法添加物專項(xiàng)檢測任務(wù)[1]，在抽檢的楊樹花口服液中檢出了處方外成分黃芩苷[2]，建立了楊樹花口服液中非法添加物黃芩苷的測定-超高效液相色譜法。研究通過優(yōu)化流動(dòng)相梯度洗脫等色譜條件，提高了分離效果，可以作為定性、定量的確證方法，為制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，以及非法添加物專項(xiàng)任務(wù)提供檢驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 分析天平：感量0.00001 g；儀器 Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色譜儀。

1.2 藥品及試劑 黃芩苷，批號110715-201016，含量94.0%，中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：水溶液(0.4%磷酸)，進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。二極管陣列檢測器，檢測波長為278 nm。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Gradient elution condition table

2.2 樣品制備

2.2.1 陰性樣品5批 5家企業(yè)報(bào)批的楊樹花口服液經(jīng)檢驗(yàn)不含有黃芩苷。待檢的抽檢樣品1批。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 精密稱取黃芩苷對照品10.64 mg，加甲醇至50 mL，制成200 μg/mL的溶液，作為外標(biāo)儲備液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液，用初始比例流動(dòng)相稀釋，制備成系列濃度為：0.1、0.25、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4 陽性添加樣品的制備 精密量取黃芩苷儲備液適量，加1 mL楊樹花口服液，置25 mL容量瓶中，配置成的0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL的楊樹花口服液陽添加樣品，加入50%甲醇適量，超聲處理20 min，加入50%甲醇定容搖勻，靜置(或離心)，濾過；取濾液1.6 mL，加初始流動(dòng)相至10 mL，搖勻，0.22 μm濾膜濾過，作為陽性添加樣品。陽性樣品和待測樣品同法處理。每個(gè)添加濃度制備三份平行樣，每份樣品至少進(jìn)樣2次，取平均值。報(bào)告12個(gè)回收率測定結(jié)果并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，見表2。

表2 陽性添加樣品制備表Tab 2 Sample preparation schedule for positive addition

2.3 方法線性考察及添加回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可以有效地分離黃芩苷，在0.5～100 μg/mL的范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=94800X+10600，Y為黃芩苷峰面積，X為黃芩苷的濃度，其相關(guān)系數(shù)R2為0.999，線性良好。

2.3.2 方法的檢測限和定量限 陰性樣品經(jīng)檢測不含黃芩苷，含有防腐劑苯甲酸，楊樹花口服液中添加黃芩苷，液相色譜與苯甲酸分離良好，無其他干擾，添加0.05 mg/mL，信噪比(S/N)>3，確定為方法的檢測限；添加0.1 mg/mL，信噪比(S/N)>10，確定為方法的定量限；根據(jù)藥物發(fā)生藥效所需要的可能添加的濃度，檢測限和定量限足以滿足要求。

2.3.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度 楊樹花口服液中添加濃度分別0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL，批內(nèi)批間變異系數(shù)均小于10%，陽性添加樣品的回收率在95%～105%，見表3。準(zhǔn)確度和精密度良好，完全滿足檢測需求。

表3 楊樹花口服液中添加黃芩苷的回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=12)Tab 3 Test result of recovery rate of baicalin added in yangshuhua koufuye

2.4.4 抽檢樣品的結(jié)果判定 空白樣品色譜圖未檢出黃芩苷，黃芩苷對照溶液、抽檢陽性樣品的色譜圖見圖1～圖2，其黃芩苷出峰的保留時(shí)間一致，初步判定抽檢樣品添加了黃芩苷；對抽檢陽性樣品光譜圖與黃芩苷對照溶液光譜圖(圖3)進(jìn)行比較，非常一致，抽檢樣品保留時(shí)間4.987 min的色譜峰純度角0.045，純度閾值0.248，純度角小于純度閾值，說明光譜均勻，未包裹共流出物，滿足檢測要求(圖4)，最終確證抽檢樣品非法添加了黃芩苷，通過含量計(jì)算，其楊樹花口服液中黃芩苷含量高于15 mg/mL。

圖1 50μg/mL黃芩苷對照品色譜圖Fig 1 50μg/mL Baicalin control chromatogram

圖2 檢出抽檢陽性樣品色譜圖Fig 2 Sampling detection positive sample chromatogram

圖3 黃芩苷光譜圖Fig 3 Baicalin spectorgram

圖4 黃芩苷純度圖Fig 4 Baicalin Purity map

3 討論與結(jié)論

3.1 選用超高效液相色譜儀，檢測方法準(zhǔn)確經(jīng)濟(jì)快速 本實(shí)驗(yàn)室是在檢測楊樹花口服液中是否含非法添加物時(shí)，采用超聲提取法，濾過上機(jī)檢測，偶爾發(fā)現(xiàn)了非目標(biāo)峰峰形尖銳，峰面積異乎尋常的巨大，經(jīng)過眾多的化藥和抗生素光譜圖進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)均不是，后發(fā)現(xiàn)其色譜出峰時(shí)間和光譜圖與黃芩苷非常一致，然后選擇0.4%磷酸和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行方法驗(yàn)證，選擇超高效液相PDA檢測器，梯度洗脫，與苯甲酸分離度滿足要求，系統(tǒng)適應(yīng)性良好。用超高效液相色譜運(yùn)行一針需要10 min，比一般的液相色譜時(shí)間節(jié)約了30 min，流速為0.35 mL，流動(dòng)相節(jié)約了36.5 mL,不僅減少了實(shí)驗(yàn)室耗能耗電，還減少了廢液排放，符合綠色節(jié)能減排的原則。

3.2 色譜柱和柱溫的選擇 一開始選用了ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱，分離效果和峰形較差，后選用了ACQUITY UPLCTMHSS T3色譜柱，使得苯甲酸和黃芩苷分離較好，峰形較好。在柱溫條件優(yōu)化時(shí)，選擇了柱溫30 ℃、35 ℃、40 ℃，比較發(fā)現(xiàn)35 ℃效果最好，一是與40 ℃比較，與防腐劑苯甲酸分離度較好，而與30 ℃比較系統(tǒng)壓力相對較小，最終選擇了柱溫35 ℃。通過光譜圖顯示黃芩苷在278 nm 存在最大吸收，故波長選擇278 nm。

3.3 非法添加黃芩苷的潛在風(fēng)險(xiǎn) 黃芩苷是黃芩提取物、雙黃連口服液、銀黃提取物口服液、清解合劑、黃連解毒散、龍膽瀉肝散、郁金散、四黃止痢顆粒等中獸藥中起重要作用的一種組分，具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效，用于治療濕熱、瀉痢等；隨著黃芩提取物等中藥良好的治療效果及全國范圍內(nèi)的推廣應(yīng)用，其他獸藥中如若再非法添加黃芩苷，有可能造成劑量過大，引起不良反應(yīng)[2]。

3.4 非法添加物篩查的合理性分析 查資料證實(shí)楊樹花水提液中主要化學(xué)成分包括多糖、黃酮類、有機(jī)酸、強(qiáng)心甙、內(nèi)酯及香豆素,蒽醌類化合物、酚類或鞣質(zhì)，植物甾醇等，而且白毛楊雄花序含有多種黃酮類化合物，主要有山奈酚、芹菜素、槲皮素、木犀草素、水楊苷等，但是不含有黃芩苷[3-5]，而且文獻(xiàn)報(bào)道楊樹花與黃芩復(fù)方研發(fā)的注射液對仔豬瀉痢等有良好的協(xié)同作用[4]，因此其非法添加符合邏輯規(guī)律。

3.5 方法適用范圍及說明 實(shí)驗(yàn)只針對楊樹花口服液中黃芩苷非法添加物的檢測進(jìn)行了方法學(xué)的考察驗(yàn)證，因?yàn)椴煌瑯悠繁尘盎|(zhì)效應(yīng)差異很大，需要進(jìn)一步研究其他獸藥單方或復(fù)方中黃芩苷的檢測方法，為進(jìn)一步制訂地方或國家非法添加物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，保障養(yǎng)殖業(yè)用藥安全，保障動(dòng)物食品安全和公共衛(wèi)生安全。

本方法建立了超高效液相色譜法測定楊樹花口服液中非法添加物黃芩苷，采用外標(biāo)法，對樣品進(jìn)行提取稀釋后測定，專屬性強(qiáng)、靈敏度高、檢測限低。通過方法學(xué)考察，完全適合楊樹花口服液中黃芩苷非法添加的定性、定量檢測。

[1] 農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]2號文農(nóng)業(yè)部關(guān)于印發(fā)《2017年獸藥質(zhì)量監(jiān)督抽檢計(jì)劃》的通知 [Z]. 2017.

Agricultural medicine [2017]2 paper on the Ministry of Agriculture issued 2017 quality supervision and sampling of veterinary drugs plan notice [Z]. 2017.

[2] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典2015年版 [S].

China Veterinary Pharmacopoeia Committee. People's Republic of China Veterinary Pharmacopoeia, 2015 edition[S].

[3] 王艷萍，董林，郭世金,等，楊樹花中黃酮類化合物的種類及其藥理作用[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2012，4(2):97-98.

Wang Y P, Dong L, Guo S J,etal. Flavonoids in poplar flower species and Pharmacological action [J]. Heilongjiang animal husbandry and veterinary medicine, 2012,4 (2): 97-98.

[4] 房春林. 楊樹花及其復(fù)方制劑藥學(xué)與臨床應(yīng)用研究，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文[D].2010.

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[5] 韓立，班付國，周紅霞，等. 高效液相色譜法測定楊樹花口服液中水楊苷的含量[J].中國獸藥雜志，2014(6)：25-27.

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