幼年暹羅鱷致病性簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌的分離鑒定

蒲文淵，曾紀(jì)鋒，鄭 挺，歐秀全，楊 諾，郭桂英，王 宇，鄭繼平*

(1.海南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，海南 海口570228；2.海南大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，海南 ?？?70228；3.陵水華天龍養(yǎng)殖有限公司，海南 陵水572435；4.海南省陵水縣光坡鎮(zhèn)人民政府，海南 陵水572400)

簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌屬于氣單胞菌屬，為運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌，與嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌等其它氣單胞菌，作為養(yǎng)殖水體及水生動(dòng)物體內(nèi)正常存在的菌群[1]，通常不引起感染。若動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)下，如動(dòng)物的運(yùn)輸、抓捕、受傷以及水溫變化等，致使細(xì)菌快速增殖，突破機(jī)體屏障，侵入體內(nèi)引發(fā)疾病[2]。迄今為止，已報(bào)道簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌作為病原引起的動(dòng)物發(fā)病的病例有羅非魚、歐洲鰻、虎頭鯊、斑馬貽貝以及人的糖尿病繼發(fā)感染、傷口感染等[3]，但鱷魚的簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌感染發(fā)病尚未見報(bào)道。

2016年4月海南陵水地區(qū)某鱷魚養(yǎng)殖場(chǎng)多只10月齡仔鱷魚出現(xiàn)厭食、精神沉郁、四肢無力及腹下皮膚出血等癥狀，病理解剖，主要病變見肺部淤血，肝輕度腫大，淤血。從病死的仔鱷魚體內(nèi)分離獲得一株致病性病原菌，采用細(xì)菌形態(tài)觀察及生理生化特征測(cè)定等常規(guī)表型鑒定方法，并結(jié)合16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，確認(rèn)其為簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌。同時(shí)對(duì)該菌株進(jìn)行致病性試驗(yàn)及抗菌藥物敏感試驗(yàn)，為該病的診斷和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 病料樣品采自海南陵水地區(qū)某鱷魚養(yǎng)殖場(chǎng)死亡的10月齡的幼年暹羅鱷，主要病變見腹下皮膚有出血點(diǎn)，肺淤血及肝淤血、腫大，無菌采集心血、肝臟、脾、肺組織；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NIH小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量為23±2 g。

1.2 主要試劑Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基購自英國(guó)OXIOD公司；細(xì)菌生化微量鑒定管和抗菌藥物紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、10×緩沖液、DL2000 DNA Marker、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和瓊脂糖凝膠，購自北京艾德萊生物科技有限公司；pXT19-T載體購自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 細(xì)菌的分離 無菌采集死亡鱷魚的心血、肝、肺病變組織分別接種于血瓊脂平板，采用有氧及厭氧培養(yǎng)方法，28℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落劃線培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌株。同時(shí)，將病變脾、肝、肺臟器組織樣品加入無菌生理鹽水進(jìn)行研磨，反復(fù)凍融后，3 000 r/min離心20 min，吸取上清液，經(jīng)0.22μm細(xì)菌濾器過濾，濾液腹腔接種NIH小鼠，0.2 mL/只，連續(xù)觀察7 d。

1.4 細(xì)菌形態(tài)及理化特性鑒定 取分離純化后的菌株，命名為陵水5號(hào)(LS5)，劃線接種于TSA瓊脂培養(yǎng)平板和普通瓊脂平板中，28℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài)，取細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀查其形態(tài)；將純化的LS5菌株接種于細(xì)菌生化微量管中，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌生化特性的測(cè)定，具體試驗(yàn)方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及細(xì)菌生化微量鑒定管操作說明書進(jìn)行。

1.5 16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析 按照DNA快速提取試劑盒所述方法，提取LS5菌株基因組DNA，以其為模板，采用細(xì)菌16S rRNA通用引物(F：5'-GGGATAACTACTGGAAACGGTA-3'/R：5'-GAAGGCACTCCCGTATCTCTA-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：94℃3 min；93℃30 s、54℃30 s、72℃90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min；PCR產(chǎn)物回收純化后克隆至pXT19-T載體中，陽性的重組質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

將分離菌16S rRNA測(cè)序結(jié)果與已知GenBank數(shù)據(jù)庫中的核酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)，利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行序列同源性分析，通過Neighbor-Joining方法，構(gòu)建LS5系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 致病性試驗(yàn) 將菌株LS5接種于TSA瓊脂斜面，28℃恒溫培養(yǎng)16 h～20 h，滅菌生理鹽水洗下菌苔，采用菌落計(jì)數(shù)法調(diào)整菌懸液濃度為5.4×108cfu/mL，再用生理鹽水10倍梯度稀釋為5.4×108cfu/mL～5.4×103cfu/mL，取不同稀釋度菌液腹腔注射NIH小鼠，劑量為0.2 mL/只，每組10只小鼠，對(duì)照組為腹腔注射0.2 mL/只的生理鹽水，連續(xù)觀察7 d。采集死亡小鼠脾、肝、心血等組織對(duì)病原菌進(jìn)行再次分離，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色、形態(tài)檢查及生理生化特性測(cè)定，采用改良寇氏法計(jì)算其半數(shù)致死量(LD50)[4]。

1.7 抗菌藥物敏感試驗(yàn) 采用改良Kirby-Bauer法[5]對(duì)LS5株細(xì)菌進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，參照杭州天和微生物試劑有限公司《藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)》判定該菌對(duì)抗菌藥物的敏感程度。

2 結(jié)果與討論

2.1 病原菌的分離及形態(tài)特征 將死亡仔鱷魚進(jìn)行病理剖檢，取肝、肺、心血組織病料樣品在血瓊脂平板劃線培養(yǎng)，均長(zhǎng)出形態(tài)單一，呈β溶血的菌落，各挑一個(gè)單一菌落經(jīng)純化后，劃線接種TSA瓊脂培養(yǎng)基上，形成圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)、中央隆起、不透明、灰白色的菌落；革蘭氏染色檢查均為革蘭陰性，菌體短小，多為單個(gè)排列，無芽胞、無莢膜桿菌，生理生化特性測(cè)定也均一致(圖1)。因此，確認(rèn)為同一細(xì)菌，把心血分離獲得的菌株命名為L(zhǎng)S5株。心血、肝、肺組織研磨液經(jīng)0.22μm細(xì)菌濾器過濾后，將濾液接種NIH小鼠，觀察期間未發(fā)現(xiàn)其發(fā)病及死亡現(xiàn)象。

圖1 分離菌株革蘭氏染色鏡檢(1000×)Fig.1 Microscopic examination of the isolate by Gram staining(1000×)

2.2 病原菌的生理生化測(cè)定 參照文獻(xiàn)[3]的標(biāo)準(zhǔn)，生理生化測(cè)定結(jié)果顯示，分離菌株LS5的生化特性與簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌基本一致，可初步確定LS5為簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌(Aeromonas jandaei)(表1)。

2.3 16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建分離菌株LS5的16S rRNA基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得的片段約為1 500 bp，與預(yù)期大小一致。在NCBI中采用BLAST，對(duì)LS5菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行分析，構(gòu)建LS5進(jìn)化樹(圖2)。菌株LS5在NCBI中與FJ940830.1Aeromonas jandaeipW23菌株同源性高達(dá)100 %，同時(shí)在系統(tǒng)發(fā)育樹中與FJ940830.1Aeromonas jandaeipW23位于同一進(jìn)化分支。因此，結(jié)合菌株的表型特征、生理生化特性鑒定與16S rRNA序列分析，可以判定菌株LS5為簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌Aeromonas jandaei。

2.4 致病性試驗(yàn) 海南地區(qū)每年的3月至4月，晝夜溫差大，仔鱷魚養(yǎng)殖池水量少，水溫波動(dòng)較大，仔鱷魚體溫日夜溫差變化大，易導(dǎo)致其感染患病。Roh報(bào)道了將鱷魚養(yǎng)殖溫度從16℃提高至26℃，由于環(huán)境溫度的改變過大，導(dǎo)致了鱷魚體溫調(diào)節(jié)障礙，引發(fā)鱷魚氣單胞菌感染患病死亡病例[6]。本研究獲得分離菌株LS5接種NIH小鼠多在24 h～72 h內(nèi)死亡，顯示對(duì)NIH小白鼠有較強(qiáng)的致病性，死亡小鼠可見肝臟和肺充血、出血，脾臟充血腫大，心包積多量液體，從死亡小鼠中進(jìn)行病原再次分離培養(yǎng)，可分離獲得形態(tài)和生理生化特征與LS5株特征一致的菌株。采用改良寇氏法計(jì)算LS5對(duì)NIH小白鼠的LD50為4.1×105cfu/只。表明簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌分離株對(duì)小鼠的致病力強(qiáng)，能夠引起小鼠感染死亡；而鱷魚的組織濾液對(duì)小鼠致病試驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)發(fā)病及死亡，表明簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌感染是引起幼年鱷魚發(fā)病死亡的主要原因，環(huán)境溫度的強(qiáng)烈變化是其發(fā)病的主要誘因。

表1 分離菌株LS5的生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Main biochemical characteristics tested for the isolate LS5

圖2 基于LS5 16S rRNA基因構(gòu)建的LS5分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence of isolate LS5

2.5 藥敏試驗(yàn) 鱷魚的細(xì)菌性疾病防治主要依靠抗菌藥物，25種抗菌藥物的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示，簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌分離株LS5對(duì)紅霉素、鏈霉素、克林霉素等9種抗生素耐藥；對(duì)新霉素、諾氟沙星等3種抗生素中度敏感；對(duì)慶大霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考等13種抗生素敏感；其耐藥譜與報(bào)道的羅非魚簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌NL05株有差異[7]，NL05株對(duì)第一代頭孢霉素均耐藥而LS5則顯示敏感；從斑點(diǎn)叉尾鲖分離殺鮭氣單胞菌ry01株[8]，雖然有種的差別，但其耐藥性與LS5差別卻較小，這或許與養(yǎng)殖過程中抗生素的使用狀況及養(yǎng)殖環(huán)境有較大的關(guān)系。藥敏試驗(yàn)的結(jié)果可為鱷魚細(xì)菌性疾病防治提供一定依據(jù)，但由于鱷魚飼喂的特點(diǎn)，藥物的定時(shí)定量投給較為困難，抗菌藥物的治療效果并不理想，因此加強(qiáng)仔鱷魚飼養(yǎng)管理，依據(jù)實(shí)際情況對(duì)養(yǎng)殖池水溫適當(dāng)調(diào)控，并對(duì)池水進(jìn)行適當(dāng)?shù)膿Q水及消毒，預(yù)防為主，治療為輔，降低幼齡鱷魚的發(fā)病率，這對(duì)鱷魚養(yǎng)殖業(yè)的健康養(yǎng)殖尤為重要。

鱷魚的氣單胞菌感染發(fā)病的文獻(xiàn)報(bào)道僅見于嗜水氣單胞菌引起鱷魚的皮膚損傷、潰瘍、出血、壞死性腸炎、肺炎和敗血癥[9]，嗜水氣單胞菌之外其它氣單胞菌感染尚未見報(bào)道，本研究從發(fā)病死亡的幼齡鱷魚中，分離出簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌，經(jīng)過表型與分子生物學(xué)鑒定及致病性試驗(yàn)，首次確認(rèn)了鱷魚的簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌感染。同時(shí)對(duì)該株簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌的毒性進(jìn)行了分析，顯示其具有較強(qiáng)致病力。最后通過對(duì)鱷魚感染的簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌藥敏分析，給出了相關(guān)防治措施。