梓醇對(duì)擬AD模型小鼠小河馬突觸可塑性的修復(fù)作用

宋沖，曹斌

（長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410219）

引言

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，患病人群主要體現(xiàn)在老年人群。出現(xiàn)記憶力丟失、認(rèn)知能力減弱。AD 病人的皮層活組織檢查發(fā)現(xiàn)突觸密度下降25-35%，并且每個(gè)神經(jīng)元的突觸數(shù)目減少15-35%[1]。突觸丟失在海馬組織更明顯，可達(dá)到44-55%[2]。在早期AD 的突觸病理變化中，除了突觸連接丟失還會(huì)出現(xiàn)突觸功能低下。本文擬采用梓醇干預(yù)小鼠小河馬AD模型，深入研究梓醇對(duì)小鼠突觸可塑性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7W 小鼠小河馬。光照時(shí)間12 h 交替，體重（30±5）g，清潔度良好，自由進(jìn)水進(jìn)食。

儀器：小鼠小河馬腦立體定位儀：美國(guó)STOELTING公司產(chǎn)品；微量注射器（1μl）：醫(yī)用激光儀器廠；電動(dòng)牙科鉆：SAESHIN 公司產(chǎn)品；Y-迷宮測(cè)定儀：張家港市生物醫(yī)學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用模型制作參照小鼠腦標(biāo)準(zhǔn)圖譜，采用Aβ25-35 加IBO 混合后一次腦內(nèi)定位注射法，右腦單側(cè)注射。動(dòng)物分為三組，分別為①對(duì)照組；②模型組；③梓醇用藥組。實(shí)驗(yàn)組小鼠小河馬均按每天50 mg/kg 經(jīng)胃管喂服梓醇，對(duì)照組及模型組小鼠小河馬喂藥等體積蒸餾水，灌服共60 d，每天一次。對(duì)照組：10 只，每日以蒸餾水灌胃，連續(xù)60 d。模擬組：10 只，每日以蒸餾水灌胃，連續(xù)60 d。梓醇組：10 只，每日以梓醇水溶液50 mg/kg/d 灌胃，連續(xù)60 d。Y-迷宮測(cè)試，在實(shí)驗(yàn)前將小鼠小河馬分別放入迷宮適應(yīng)5 min。模型制作60d 后進(jìn)行Y-迷宮測(cè)試，工作電壓為35-45 伏[3-4]。Y-迷宮由3個(gè)相同的臂組成，分別稱為I 臂，II 臂，III 臂。首先將小鼠小河馬跟別放入不帶電的臂（I 臂，起始臂），轉(zhuǎn)換按鈕，使小其所在臂帶電面順時(shí)針的臂（II 臂，安全臂）不帶電，逆時(shí)針臂（III 臂，電擊臂）帶電，分別驅(qū)使小鼠小河馬離開(kāi)原所在臂。若小鼠小河馬直接進(jìn)入順時(shí)針臂（II 臂）則判斷為“正確反應(yīng)”，相反則判斷為“錯(cuò)誤反應(yīng)”，燈光持續(xù)5 s，然后開(kāi)始下一次實(shí)驗(yàn)。起始臂為II 臂，安全臂為III 臂，電擊臂為I 臂，依次進(jìn)行轉(zhuǎn)換，每天測(cè)試20 次。記錄連續(xù)7 d 的正確反應(yīng)次數(shù)和訓(xùn)練20次所需的總時(shí)間min，以第7 d 的結(jié)果作為衡量小鼠小河馬學(xué)習(xí)（近期記憶）能力的指標(biāo)。

放射配基結(jié)合分析單點(diǎn)分析法測(cè)定注射側(cè)腦內(nèi)M 膽堿受體密度，放射酶學(xué)法測(cè)定內(nèi)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase，ChAT）的活性，ELISA 法測(cè)定腦內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derivedbeurotrophic factor，BDNF）的含量。

2 結(jié)果

梓醇組第7 d 20 次測(cè)試正確次數(shù)（18.33±0.98），顯著好于模型組（16.15±2.30），與對(duì)照組（19.38±0.92）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。梓醇組7 d 20 次測(cè)試的正確次數(shù)/總反應(yīng)時(shí)間（8.41±0.80）也顯著好于模型組（5.92±1.20）且與對(duì)照組（9.18±0.63）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。放射配基結(jié)合分析單點(diǎn)測(cè)定注射側(cè)腦內(nèi)M 膽堿受體密度，對(duì)照組（1090±108 fmol/mg Pro），模型組（925±58 fmol/mg Pro）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ELISA 法測(cè)定腦內(nèi)BDNF 含量結(jié)果顯示，與模型組（0.733±0.221 pg/ug Pro）相比，梓醇組BDNF 含量顯著提高（0.849±0.208 pg/ug Pro），且對(duì)照組（0.832±0.216 pg/ug Pro）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[5]。

3 討論

AD 是一種以慢性進(jìn)行性的記憶力減退、認(rèn)知功能障礙及精神行為異常為主要臨床特征的神經(jīng)變性疾病。由于病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前市場(chǎng)上尚無(wú)阻止、延緩或防止這一疾病發(fā)生和發(fā)展的藥物。有效治療方法的缺乏與疾病快速進(jìn)展之間存在著尖銳的矛盾。因此，探尋有效的抗AD 防治措施，不僅是目前生物醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，也必將成為經(jīng)濟(jì)建設(shè)和社會(huì)發(fā)展亟待解決的一個(gè)重大問(wèn)題。

梓醇主要是從中藥地黃根部分離提純得到的一種小分子糖苷，是地黃的主要有效成分之一，分子量為362.45。研究表明，梓醇具有廣泛的藥理活性。自由基損傷是腦缺血損傷的重要機(jī)制之一，神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧和自由基直接作用于線粒體膜，ATP 產(chǎn)生迅速減少，Ca2+超載誘發(fā)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)外的腦缺血研究表明，梓醇治療后，凋亡細(xì)胞顯著減少，同時(shí)內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性顯著提高，如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶等，并且，丙二醛、活性氧自由基的含量和一氧化氮合酶的活性明顯下降，這說(shuō)明梓醇通過(guò)提高抗氧化酶活性，增加自由基的清除，抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠小河馬AD 模型進(jìn)行梓醇干預(yù)，行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，梓醇明顯改善了動(dòng)物模型的近期記憶，而放射配基結(jié)合分析單點(diǎn)測(cè)定結(jié)合ELISA 法監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)梓醇干預(yù)后，BDNF含量顯著提高。本實(shí)驗(yàn)證明，動(dòng)物單側(cè)腦基底核部位一次性定位注射淀粉樣肽Aβ25-35 和IBO 可造成穩(wěn)定癡呆模型，應(yīng)用梓醇能明顯改善擬癡呆小鼠小河馬的短期記憶能力，對(duì)AD 具有顯著治療改善作用。