HPLC法同時(shí)測(cè)定達(dá)原飲中芒果苷等6種成分的含量

王金艷 ，任 靜 ，陳世彬 ，姚少姿 ，馬 麗 ，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 300193；3.華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，深圳 518110）

達(dá)原飲出自明代醫(yī)家吳有性的《溫疫論》，由檳榔、厚樸、草果、知母、白芍、黃芩、甘草7味中藥組成，具有開達(dá)膜原，辟穢化濁的功效，主治瘟疫或瘧疾邪伏膜原之證[1]。方中檳榔為君藥，辛散濕邪；草果辛香化濁，厚樸芳香化濁，共為臣藥；佐白芍、知母清熱滋陰，佐黃芩清熱燥濕；甘草為使藥，既能清熱解毒，又能調(diào)和諸藥[2]。從達(dá)原飲的現(xiàn)代臨床應(yīng)用看，其適應(yīng)癥十分廣泛，然而都離不開共同的病機(jī)，即“膜原證”，常用于各種發(fā)熱、盜汗、扁桃體炎、便秘、淋證、腹脹等多種疾病[3-6]，療效頗佳。目前達(dá)原飲質(zhì)量控制方面的研究較少，有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，針對(duì)達(dá)原飲相關(guān)制劑中1個(gè)或2個(gè)成分（如黃芩苷）進(jìn)行含量測(cè)定來控制制劑質(zhì)量。但中藥復(fù)方中成分復(fù)雜，單一指標(biāo)成分的含量測(cè)定難以較全面控制質(zhì)量，有必要結(jié)合達(dá)原飲處方藥味特點(diǎn)，建立多指標(biāo)成分的含量控制方法。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）在同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定達(dá)原飲中芒果苷等6種活性成分含量的方法，旨在為達(dá)原飲制劑的開發(fā)提供一種更全面的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與材料

1.1儀器 Agilent1260高效液相色譜儀（四元泵，VWD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，OpenLAB工作站，美國(guó)安捷倫公司）；Sorvall ST16R高速離心機(jī)（德國(guó)Thermo Scientific公司）；Milli-Q超純水機(jī)（德國(guó)Millipore公司）；Mettler Toledo XP205電子分析天平（Mettler Toledo儀器有限公司）；FA 124型天平（上海舜宇恒平有限公司）。

1.2試劑 黃芩苷（批號(hào)110715-201318）、芍藥苷（批號(hào) 110736-201438）、芒果苷（批號(hào) 111607-200402）、甘草酸銨（批號(hào) 110731-201418）、厚樸酚（批號(hào)110729-200412）、和厚樸酚（批號(hào)110730-201313）對(duì)照品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。甲醇、乙睛均為色譜純，F(xiàn)isher scientific公司；水為超純水，磷酸為色譜純，購(gòu)于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。檳榔、厚樸、草果、知母、白芍、黃芩、甘草的藥材信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，柱溫 30 ℃，流速 0.8 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL，流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%磷酸水（B）進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見表2。

表1 藥材來源

表2 梯度洗脫程序表

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸銨、厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度分別為:158.20、336.82、1478.99、90.30、17.18、5.37 mg/L 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取 0.5、1、2、4、5、6、10 mL 儲(chǔ)備液置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得系列混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 按處方稱取上述7味藥材置2 L的煎藥壺中，加適量水，浸泡，加蓋煎煮，濾除藥渣，得濾液；精密量取濾液5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，取適量12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液及供試品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果6種被測(cè)成分均能達(dá)到基線分離，與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以各色譜峰計(jì)均超過10 000，峰形較好。HPLC色譜圖見圖1。

2.4線性關(guān)系考察 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別吸取系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別按照色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表3。

圖1 6種混合對(duì)照品溶液（A）和供試品溶液（B）HPLC色譜圖

表3 6種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5精密度 取混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積為10 μL，以對(duì)照品峰面積進(jìn)行計(jì)算，芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸、厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為1.34%、1.89%、1.55%、0.70%、1.44%、1.64%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性 取供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，分別在 0、2、4、8、16、24、36 h 進(jìn)樣，測(cè)定芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸、和厚樸酚、厚樸酚的峰面積，按峰面積計(jì)算得RSD%分別為0.31%、0.83%、0.54%、1.79%、1.11%、1.79%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫條件下放置36 h穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性 取同一批達(dá)原飲煎液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液6份，精密吸取溶液10 μL，按"2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別測(cè)得芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸、和厚樸酚、厚樸酚含量的RSD分別為0.22%、1.02%、0.36%、0.96%、0.32%、0.38%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.8回收率 精密移取同一批達(dá)原飲藥液2.5 mL，共9份，分別精密加入高、中、低3個(gè)水平的芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸銨、厚樸酚、和厚樸酚對(duì)照品，每個(gè)水平3份，按"2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液并進(jìn)樣分析。結(jié)果芒果苷、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸、和厚樸酚、厚樸酚的平均回收率分別為102.2%、98.6%、100.7%、97.5%、99.3%、101.1%，RSD分別為1.83%、1.61%、1.68%、1.30%、1.67%、1.91%。

2.9樣品測(cè)定 分別稱取處方量的上述7味藥材置2 L的煎藥壺中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，平行6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算樣品中6種指標(biāo)成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 達(dá)原飲中芒果苷等6種有效成分的含量（n=6）

結(jié)果表明，同一產(chǎn)地、同一批次的6份達(dá)原飲煎液中各個(gè)指標(biāo)的含量存在一定的差異，分析可能與制備煎液的藥味處方量少、藥材飲片規(guī)格、大小不一等有關(guān)。

3 討論

達(dá)原飲由檳榔、厚樸、草果、知母、白芍、黃芩、甘草7味藥材組成，參照藥典及文獻(xiàn)[8-16]，其主要指標(biāo)性成分分別為檳榔堿、厚樸酚、和厚樸酚、芒果苷、知母皂苷BⅡ、芍藥苷、黃芩苷、甘草酸。檳榔堿為小分子生物堿，在C18柱上幾乎無保留[17]，而知母皂苷BⅡ?yàn)樽贤鈪^(qū)末端吸收[18-19]，由于紫外檢測(cè)器的檢測(cè)范圍的有限性、常用C18柱的選擇性都不足以同時(shí)對(duì)上述所有指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析，因此采用廣泛使用的反相高效液相色譜紫外法（HPLCUV）選擇其中6種主要活性成分進(jìn)行含量測(cè)定。

分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脫作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)乙腈-水、甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，芍藥苷拖尾嚴(yán)重，而乙腈作有機(jī)相的分離效果更好，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作流動(dòng)相，各峰的保留時(shí)間合適且拖尾現(xiàn)象有一定改善，進(jìn)一步加大流動(dòng)相中酸的含量，用0.2%磷酸代替0.1%磷酸，拖尾現(xiàn)象顯著改善，提高了分析靈敏度，故選定其為流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)掃描供試品溶液200～400 nm的二極管陣列檢測(cè)器（DAD）的光譜譜圖，確定幾個(gè)較好的檢測(cè)波長(zhǎng)，分別為 215、230、254、280、294 nm，采用HPLC進(jìn)行單個(gè)波長(zhǎng)測(cè)定，綜合考慮色譜峰峰高和分離度，可知在波長(zhǎng)230 nm下為最佳，最終確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

厚樸作為方中臣藥，其主要活性成分厚樸酚、和厚樸酚在達(dá)原飲中的含量較低，分析原因在于厚樸酚、和厚樸酚均為脂溶性成分[20]，在水中的溶解度小，而達(dá)原飲煎液采用水作為溶劑提取，因此煎液中厚樸酚、和厚樸酚含量低。黃芩苷作為黃芩的主要活性成分，在達(dá)原飲中的含量高。黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，在方中發(fā)揮著重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC方法可快速定量測(cè)定達(dá)原飲中的6種主要藥效成分。本方法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確、精密度高，為達(dá)原飲的全面質(zhì)量控制提供更為可靠的保證。

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