糖尿病合并結(jié)核感染的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)分析

游元飛

[摘要] 目的 分析糖尿病合并結(jié)核感染利用不同結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)的效果。方法 選擇該院2018年1—6月中的100例糖尿病合并結(jié)核感染患者，收集患者痰標(biāo)本分別應(yīng)用4種不同方法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)，分析檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果 100份痰涂片經(jīng)涂片法檢測(cè)的陽(yáng)性率為27%，經(jīng)快速培養(yǎng)法檢測(cè)的陽(yáng)性率為38%，經(jīng)噬菌體法檢測(cè)的陽(yáng)性率為37%，經(jīng)PCR法檢測(cè)的陽(yáng)性率為39%，涂片法陽(yáng)性率明顯低于其他3種方法（P<0.05）。 結(jié)論 噬菌體生物擴(kuò)增法和熒光定量PCR法相較涂片法和培養(yǎng)法能夠更準(zhǔn)確、迅速完成結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)，可推廣用于糖尿病合并結(jié)核感染的診斷中。

[關(guān)鍵詞] 糖尿?。唤Y(jié)核感染；結(jié)核分枝桿菌；檢測(cè)

[中圖分類號(hào)] R446 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-4062（2018）12（a）-0059-02

結(jié)核病屬于一類多發(fā)的慢性疾病，對(duì)患者健康有嚴(yán)重影響，糖尿病被認(rèn)為是結(jié)核病的易感者，15%左右的肺結(jié)核患者伴發(fā)糖尿病，大部分都是先出現(xiàn)糖尿病，再出現(xiàn)肺結(jié)核[1]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者出現(xiàn)結(jié)核病的可能性要高出正常人群多倍[2]。合并糖尿病的結(jié)核病患者發(fā)病急，病變主要為干酪滲出病變，應(yīng)用抗結(jié)核病治療會(huì)導(dǎo)致比較明顯的不良反應(yīng)，不良反應(yīng)會(huì)引發(fā)糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，提升病變的復(fù)發(fā)率，增加耐藥結(jié)核病患者比重[3]。所以針對(duì)糖尿病合并結(jié)核感染患者，做好早期的診斷具有重要意義，該研究具體以該院2018年1—6月中收治的100例糖尿病合并結(jié)核感染患者的100份痰標(biāo)本為對(duì)象，分析4種不同方法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以該院中的100例糖尿病合并結(jié)核感染患者的痰標(biāo)本作為檢測(cè)對(duì)象，應(yīng)用法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的BacT/ALERT 3D系統(tǒng)和試劑；選擇英國(guó)BIOTEC Lab公司生產(chǎn)的噬菌體生物擴(kuò)增法快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌試劑盒（FAST Plaque TBTM）；選擇達(dá)安基因公司生產(chǎn)的熒光定量PCR診斷結(jié)核菌試劑盒。

1.2 方法

處理痰標(biāo)本：收集好痰標(biāo)本后，選擇部分進(jìn)行金胺O熒光染色涂片，其他的給予NALC-NAOH法前處理，完成處理后將2 mL PBS加入，重懸沉淀，分別實(shí)施噬菌體生物擴(kuò)增、熒光定量PCR、快速培養(yǎng)。具體方法如下。

①快速培養(yǎng)法：選擇經(jīng)過前處理后的0.5 mL標(biāo)本在培養(yǎng)瓶進(jìn)行接種，加入經(jīng)過溶解的抗生素0.5 mL，置于BacT/A-LERT 3D結(jié)核菌培養(yǎng)儀中進(jìn)行培養(yǎng)，如果42 d之內(nèi)沒有顯示陽(yáng)性結(jié)果即確定為陰性。②熒光染色涂片法：依據(jù)《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》開展具體的操作。③熒光定量PCR法：在離心管中置入經(jīng)過前處理的標(biāo)本0.5 mL，在15 000 r/min的速度下進(jìn)行持續(xù)5 min的離心處理，除去上清液后借助TE緩沖液進(jìn)行2次洗滌沉淀。將 DNA提取液50 μL加入沉淀并混勻，進(jìn)行持續(xù)10 min的沸水浴，在10 000 r/min的速度下進(jìn)行持續(xù)5 min的離心處理，在含熒光探針的PCR擴(kuò)增體系中加入2 μL上清液，在6 000 r的速度下進(jìn)行1 min的離心處理。PCR擴(kuò)增條件：93℃下進(jìn)行3 min的預(yù)變性，接著以93℃ 1 s、57℃ 30 s循環(huán)40次，并在37℃下延伸1 s。另外設(shè)立陰性對(duì)照以及陽(yáng)性對(duì)照。完成擴(kuò)增后利用檢測(cè)儀獲取循環(huán)閾值（CT）。結(jié)果判斷：CT值沒有顯示數(shù)值為陰性，CT值≤38為陽(yáng)性，CT值>38為實(shí)驗(yàn)灰度區(qū)，必須進(jìn)行再一次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果仍按照上述標(biāo)準(zhǔn)判斷。④噬菌體生物擴(kuò)增法：選擇經(jīng)過前處理之后的標(biāo)本1 mL，加入PTB培養(yǎng)基15 mL，在4 000 r/min的速度下進(jìn)行持續(xù)15 min的離心處理，除去上清液后將PTB培養(yǎng)基1 mL加入，重懸沉淀，轉(zhuǎn)移到反應(yīng)管內(nèi)，在37℃的溫度下孵育過夜。設(shè)立陰性以及陽(yáng)性對(duì)照。在對(duì)照標(biāo)本中混勻噬菌體0.1 mL，在37℃的溫度下孵育1 h，將殺病毒劑0.1 mL加入混勻，放置在室溫下5 min，將PTB培養(yǎng)基5 mL加入混勻，將5 mL 55℃恒溫的FPTB瓊脂、敏感細(xì)胞1 mL加入，置于平皿中，室溫條件下放置讓其定型，在37℃的溫度下進(jìn)行持續(xù)24 h的培養(yǎng)。結(jié)果判斷：陽(yáng)性對(duì)照噬菌斑≥20個(gè)，陰性對(duì)照噬菌斑<10個(gè)，標(biāo)本噬菌斑≥20個(gè)為陽(yáng)性，標(biāo)本噬菌斑<20個(gè)為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

通過SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)該研究獲取的全部結(jié)果實(shí)施分析，[n（%）]表示計(jì)數(shù)資料，χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

涂片法檢測(cè)顯示陽(yáng)性的有27例，陽(yáng)性率27%；；PCR法檢測(cè)顯示陽(yáng)性的有39例，陽(yáng)性率39%噬菌體法檢測(cè)顯示陽(yáng)性的有37例，陽(yáng)性率37%；快速培養(yǎng)法檢測(cè)顯示陽(yáng)性的有38例，陽(yáng)性率38%。涂片法的陽(yáng)性率明顯低于其他3種方法（P<0.05），其他3種方法陽(yáng)性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

結(jié)核病、糖尿病都屬于我國(guó)發(fā)生率非常高的慢性疾病，且當(dāng)前逐漸增多的患者同時(shí)伴有糖尿病、結(jié)核病，這類疾病病情比較復(fù)雜，在治療上的難度大，同時(shí)停止治療后會(huì)有比較高的復(fù)發(fā)率，相較于單純結(jié)核病患者或者單純糖尿病患者，預(yù)后明顯更差[4]。臨床必須注重做好糖尿病伴發(fā)結(jié)核病感染的早期診斷，做好糖尿病患者的結(jié)核分支桿菌感染預(yù)防及控制，使患者能夠獲得及時(shí)有效的治療，預(yù)后能夠得到改善。

從該研究結(jié)果可以得知，100份痰涂片經(jīng)涂片法檢測(cè)的陽(yáng)性率為27%，經(jīng)快速培養(yǎng)法檢測(cè)的陽(yáng)性率為38%，經(jīng)噬菌體法檢測(cè)的陽(yáng)性率為37%，經(jīng)PCR法檢測(cè)的陽(yáng)性率為39%。對(duì)比結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，金胺O熒光染色涂片法的陽(yáng)性率較其他3種方法更低，其他3種方法均有30%以上的陽(yáng)性率。類似研究發(fā)現(xiàn)，以快速培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果當(dāng)作標(biāo)準(zhǔn)，分析其他方法的敏感度，結(jié)果顯示PCR法、噬菌體法的敏感性均超過90%[5]。相較于抗酸染色，熒光染色能夠獲得更高的檢出率，不過熒光染色對(duì)檢驗(yàn)人員的鏡檢水平要求較高。另外發(fā)現(xiàn)，涂片法用于檢驗(yàn)中存在比較高的漏檢率。

培養(yǎng)法被認(rèn)為使檢測(cè)結(jié)核分支桿菌的金標(biāo)準(zhǔn)，不過進(jìn)行羅氏培養(yǎng)檢出所需時(shí)間在6 h左右，雖然應(yīng)用儀器使得檢驗(yàn)所需時(shí)間得以縮短，不過得到陽(yáng)性報(bào)告所需時(shí)間在1～3周之間，獲取陰性報(bào)告所需時(shí)間為6周，這一情況使其明顯不適用于臨床診斷的實(shí)效性[6]。噬菌體生物擴(kuò)增法對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)具體應(yīng)用的是噬菌體生物特異性、快速增殖的特點(diǎn)，存在非常高的特異性、敏感度，不過這一方法檢驗(yàn)對(duì)標(biāo)本有非常高的要求。有研究數(shù)據(jù)顯示，糖尿病伴有結(jié)核感染患者應(yīng)用噬菌體法進(jìn)行痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)，陽(yáng)性率為43.3%[7]，該研究結(jié)果與之比較有一定差異，分析是由于標(biāo)本質(zhì)量上存在差異導(dǎo)致。但研究顯示噬菌體法、快速培養(yǎng)法用于糖尿病伴有結(jié)核感染患者結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)的檢出率差異不明顯，與該研究結(jié)果具有一致性。

熒光定量PCR法屬于新型的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，特異度高，敏感度高，不過少數(shù)時(shí)候會(huì)因?yàn)閿U(kuò)增導(dǎo)致污染，進(jìn)而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，另外這一檢驗(yàn)方法對(duì)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有著非常高的要求，無法推廣應(yīng)用于基層醫(yī)院。有研究顯示，熒光定量PCR法用于糖尿病合并結(jié)核感染患者結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中陽(yáng)性率在47%[8]，與該研究陽(yáng)性率結(jié)果比較存在一定差異，分析是由于不同研究選取的痰標(biāo)本存在差異造成。

針對(duì)糖尿病伴有結(jié)核感染的結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)中，涂片法、噬菌體法、熒光定量PCR法的應(yīng)用能夠保證檢驗(yàn)的特異度以及獲取結(jié)果的迅速性，相比之下，噬菌體法、熒光定量PCR法的應(yīng)用價(jià)值更明顯。培養(yǎng)法是結(jié)核分枝桿菌檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)核感染診斷必須綜合培養(yǎng)法檢驗(yàn)的結(jié)果，不過因?yàn)榕囵B(yǎng)法結(jié)果的獲取無法及時(shí)滿足臨床診斷的實(shí)效性，所以如果在診斷中應(yīng)用涂片法、噬菌體法、熒光定量PCR法有陽(yáng)性表現(xiàn)，則應(yīng)該高度懷疑為糖尿病伴發(fā)結(jié)核感染，結(jié)合培養(yǎng)法結(jié)果進(jìn)行確診。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王敏娣，孫麗娜，梁慧，等.糖尿病合并結(jié)核感染診斷中結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法的比較[J].糖尿病新世界，2017，20（2）：66-67.

[2] 李艷玲.2型糖尿病并發(fā)肺結(jié)核感染配合營(yíng)養(yǎng)治療后痰液結(jié)核分枝桿菌及免疫功能情況觀察[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，37（10）：1316-1318.

[3] 譚英征，陳雙華，肖鵬程，等.株洲地區(qū)北京基因型結(jié)核分枝桿菌感染與利福平耐藥的相關(guān)研究[J].臨床肺科雜志，2017，22（8）：1496-1499.

[4] 萬東勇，胡永芳，陳天剛.影響結(jié)核分枝桿菌耐藥的臨床相關(guān)因素分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2017，14（22）：3309-3310.

[5] 李曉非，黃山，梁桂亮，等.6種檢測(cè)方法在HIV合并結(jié)核分枝桿菌感染診斷中的應(yīng)用價(jià)值分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2017，14（3）：378-380.

[6] 曹新瑞，李雅楠，高會(huì)霞，等.滄州市結(jié)核分枝桿菌間隔區(qū)寡核苷酸分型研究[J].天津醫(yī)藥，2016，44（11）：1391-1393.

[7] 韓丹，段慧楠，饒有益，等.纖維支氣管鏡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核診斷和利福平耐藥菌株篩選的臨床價(jià)值[J].醫(yī)學(xué)綜述，2016，22（16）：3243-3246.

[8] 操敏，孫桂新，張國(guó)紅，等.2型糖尿病合并初治肺結(jié)核患者耐藥情況及影響因素分析[J].臨床肺科雜志，2016，21（10）：1757-1762.

（收稿日期：2018-09-12）