檢測創(chuàng)傷弧菌兩種毒力基因的環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立

別闖南，王 權，白雪瑞，凌 嬌，李恭賀，蔣 蔚

（1. 廣西大學，南寧530005；2. 中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

檢測創(chuàng)傷弧菌兩種毒力基因的環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立

別闖南1，王 權2，白雪瑞2，凌 嬌2，李恭賀1，蔣 蔚2

（1. 廣西大學，南寧530005；2. 中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

為建立快速檢測致病性創(chuàng)傷弧菌兩種毒素的環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal ampli fi cation，LAMP）方法,分別以創(chuàng)傷弧菌溶血素A基因（hemolysin gene A，HA）和多重毒素（repeats in toxin，RTX）毒力基因的保守序列作為靶序列設計內、外引物。通過肉眼觀察白色沉淀初步判斷檢測結果，通過瓊脂糖電泳最終確定檢測結果。LAMP檢測創(chuàng)傷弧菌的兩種基因的靈敏度都達到10 CFU/mL。特異性結果表明致病性創(chuàng)傷弧菌的結果為陽性，而其他幾種常見弧菌和食源菌檢測結果為陰性。在人工模擬樣品檢測中，LAMP結果顯示，采用水煮法提取DNA，從樣品處理到報告結果耗時1.5 h，魚肉中創(chuàng)傷弧菌的檢出限為1×102CFU/g（RTX）和1×104CFU/ g（HA）；采用同樣方法提取 DNA進行普通PCR，其檢出限為1×103CFU/g（RTX）和1×104CFU/ g（HA），耗時4 h。結果表明，本研究建立的LAMP方法檢測創(chuàng)傷弧菌兩種毒力基因時具有靈敏度高、特異性強、方法簡便等優(yōu)點，適用于食品和養(yǎng)殖業(yè)中的現(xiàn)場快速檢測。

環(huán)介導等溫擴增；溶血素A基因；多重毒素；創(chuàng)傷弧菌

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）是19世紀70年代發(fā)現(xiàn)并分離鑒定的一種嗜鹽性革蘭性陰性菌，菌體短小，呈稍彎曲的逗點狀，是弧菌中的一種低度嗜鹽菌，并且具有很高的致病性，多存在于近海、河口和水生生物中[1]。創(chuàng)傷弧菌可從牡蠣等海產品中分離得到，通過食入生的海產品，或通過人體表面?zhèn)诨蛘呤怯斡菊咄萄屎Ｋ瑒?chuàng)傷弧菌可進入人體內繁殖，并且在極短的時間內出現(xiàn)敗血癥和蜂窩組織炎、出血性大瘡，一旦出現(xiàn)敗血癥，具有很高的致死率，在海產品食源性疾病中，占據(jù)較高的比重[2]。美國佛羅里達海濱爆發(fā)“吃人肉細菌”，致死率超過30%，引起人們的極大關注，而所謂的“吃人肉細菌”就是創(chuàng)傷弧菌[3,4]。感染創(chuàng)傷弧菌后，會引發(fā)嘔吐、發(fā)燒、腹瀉、低血壓、腫脹和疼痛等癥狀，尤其容易創(chuàng)口感染，一旦感染創(chuàng)傷弧菌，患者體表傷口附近的肌肉組織將被細菌“殺死和吃掉”，免疫系統(tǒng)功能低下的人（如肝腎功能不全者）最容易感染這種致命的細菌，創(chuàng)傷弧菌嚴重影響人們的身體健康[5]。目前，對創(chuàng)傷弧菌的檢測方法主要有直接病原分離培養(yǎng)、ELISA、PCR 法、熒光定量 PCR法等[6]。

環(huán)介導恒溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本學者Notomi建立的一種適用于基層診斷的恒溫核酸擴增技術[7,8]。因其具有操作簡單，對儀器設備要求低，高特異性、高靈敏度的優(yōu)勢[9,10]，短短十年多，LAMP就在國內外各種細菌、病毒、寄生蟲等病原體檢測、食品的安全檢查及進出口快速診斷中取得廣泛引用，并得到各界的廣泛認可[11]。近幾年，LAMP也逐漸被應用到水產品弧菌的檢測中，主要是對副溶血弧菌、霍亂弧菌的檢測，而對創(chuàng)傷弧菌的應用報道較少。

本研究利用創(chuàng)傷弧菌（ATCC27562）溶血素A基因（hemolysin gene A，HA）和多重毒素（repeats in toxin，RTX）毒力基因的保守序列作為靶序列，分別設計內、外引物，建立了LAMP檢測方法。利用一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現(xiàn)對創(chuàng)傷弧菌的檢測，結果只需通過肉眼觀察是否形成白色渾濁即可快速判斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑 DK-8D型電熱恒溫水槽（購自上海精宏實驗室設備公司；PCR儀（Eppendorf AG22331）購自德國Eppendorf公司；核酸電泳儀（DYY-6D型）購自北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)（Gel DocTM EZ Imager）購自美國Bio-Rad公司；離心機（H1650-W型）購自長沙湘儀離心機儀器公司；蛋白胨、酵母提取物購自xoid公司；細菌DNA提取試劑盒購自上海天根公司；DNA Marker購自大連寶生物公司；2×PCR Taq Mix購自廣東東盛生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.2 菌株 創(chuàng)傷弧菌ATCC27562和副溶血弧菌ATCC17802購自美國菌種保藏中心（American type culture collection，ATCC）；副溶血弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌和豬鏈球菌購自中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心；霍亂弧菌1304由疾控中心惠贈。

1.1.3 樣品 經(jīng)國標法檢測為創(chuàng)傷弧菌陰性的對蝦和貝類購自當?shù)剞r貿市場。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 在GenBank上獲得創(chuàng)傷弧菌ATCC27562的HA基因和RTX毒力基因序列，分別利用DNAstar軟件分析其保守區(qū)域，再根據(jù)引物設計原則，用Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）軟件分析并設計4條引物，分別是外引物F3、B3，內引物FIP（F1+F2）、BIP（B1+B2）。HA的擴增位置為93～311區(qū)域，共218 bp目的基因片斷；RTX的擴增位置為216～430區(qū)域，共214 bp目的基因片斷。引物的名稱和具體序列見表1和表2。每條引物在基因組中具體的位置如圖1所示。引物均由上海英濰捷基貿易有限公司合成。

表1 HA基因的LAMP 引物Table 1 LAMP primers of HA gene

表2 RTX基因的LAMP 引物Table 2 LAMP primers of RTX gene

圖1 用于檢測HA和RTX的LAMP引物設計Fig.1 Design of the LAMP primers for HA and RTX detection

1.2.2 細菌的培養(yǎng)及DNA的提取 創(chuàng)傷弧菌接種于新鮮3%NaCl的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，調節(jié)菌液濃度并測OD600值。當OD600為0.2時，用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋至10-9，然后分別快速涂3%NaCl的LB固體平板, 測定其活菌數(shù)平均為1.0×108CFU/mL；同時從每個稀釋度的菌液中取1 mL用水煮法提基因組DNA，作為LAMP和PCR靈敏度檢測的模板。水煮法提DNA步驟：取1 mL菌液于EP管中，10 800×g離心2 min，棄上清；加100 μL滅菌水，充分混勻；-20℃冰浴45 min，沸水浴10 min，再冰浴10 min；最后8000×g離心4 min，收集上清，保存于-20℃?zhèn)溆?；試劑盒法（用于人工布菌試驗）：按照試劑盒使用說明書提取，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 LAMP反應體系 根據(jù)韓先干等[11]研究LAMP的基礎上進行優(yōu)化，總體系25 μL：dNTP（2.5 mmol/L；Tiangen）4 μL、10× ThermoPol buffer 2.5 μL、內引物（FIP和BIP，10 mmol/L）各4 μL、外引物（F3和B3，10 mmol/L）各1 μL、betaine（5 mmol/L；Sigma，St. Louis，MO）5.5 μL、2 μLDNA模板，經(jīng)94℃，5 min，再冰激20 s后加入1 μL（8 U）的BstDNA聚合酶（M0275；New England Biolabs，Boston，MA），最后將反應管置于63℃水浴鍋內，作用60 min，同時以無菌水為模板作為陰性對照。取出反應管，10 000×g離心2 min，目測反應管中液體渾濁度變化，判斷是否發(fā)生反應，同時取5 μL進行1%瓊脂糖凝膠進行電泳驗證。

1.2.4 LAMP特異性和靈敏度試驗 將實驗室保存的創(chuàng)傷弧菌和9種非創(chuàng)傷弧菌(沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、豬鏈球菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌、副溶血弧菌)復蘇后，調節(jié)菌液OD600值達0.2時，水煮法分別提其DNA，進行HA和RTX的LAMP特異性檢測。按照1.2.2方法中的水煮法提取DNA并進行HA和RTX的LAMP靈敏度檢測。

1.2.5 PCR法檢測 用表1和表2中的外引物（F3和B3）進行普通PCR，并與LAMP檢測結果進行比較。PCR總體系25 μL：2×PCR反應緩沖液12.5 μL、外引物（F3/ B3，10 mmol/L）各1μL、ddH2O 9.5 μL、模板DNA 1 μL。反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，55℃退火55 s，72℃延伸90 s，進行30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.6 人工布菌試驗 在當?shù)剞r貿市場采集對蝦和貝類，無菌剪碎并混合，取2 g肉糜加3%NaCl溶液至2 mL并研磨至勻漿，用試劑盒提取其基因組，按1.2.4中HA和RTX的兩條外引物（F3和B3）進行常規(guī)PCR。檢測結果顯示沒有目的片段，即該對蝦和貝類體內無創(chuàng)傷弧菌。將對蝦和貝類無菌條件下制備成1 mL含1 g肉糜的勻漿液8份，加入已倍比稀釋的創(chuàng)傷弧菌, 混勻并用3%NaCl溶液進行10倍系列稀釋至10-8，終濃度為每克肉糜中108～101CFU，分別用試劑盒提取其基因組。作為模擬樣品進行LAMP和PCR靈敏度檢測，分析其最低檢測限。

2 結果

2.1 LAMP 反應的肉眼可視結果 檢測HA的反應結果如圖1A中所示，管1未發(fā)生LAMP反應，無白色沉淀產生；管2發(fā)生LAMP反應，產生明顯的白色沉淀。檢測RTX的反應結果如圖1B中所示，管1未發(fā)生LAMP反應，無白色沉淀；管2發(fā)生LAMP反應，并產生明顯的白色沉淀。

圖1 創(chuàng)傷弧菌LAMP方法結果觀察Fig.1 Visual observation of ampli fi cation products for Vibrio vulnif i cus by LAMP method

2.2 LAMP和 PCR檢測創(chuàng)傷弧菌靈敏度的比較 LAMP檢測RTX基因時，菌液稀釋至10-6（101CFU/mL）時出現(xiàn)明顯條帶，而稀釋至10-7（100CFU/mL）時未出現(xiàn)明顯條帶，即檢測創(chuàng)傷弧菌RTX基因的靈敏度達10 CFU/mL ；LAMP檢測HA基因時，菌液稀釋至10-6（101CFU/mL）時出現(xiàn)明顯條帶，而稀釋至10-7（100CFU/mL）時未出現(xiàn)明顯條帶，即檢測創(chuàng)傷弧菌HA基因的靈敏度達10 CFU/mL，相應的沉淀如圖2中A、B所示。常規(guī)PCR檢測RTX基因時，菌液稀釋至10-6（10 CFU/mL）時未出現(xiàn)明顯條帶，即檢測創(chuàng)傷弧菌RTX基因的靈敏度達102CFU/mL；檢測HA基因時，菌液稀釋至10-6（10 CFU/mL）時未出現(xiàn)明顯條帶，即檢測創(chuàng)傷弧菌HA基因的靈敏度達102CFU/mL（圖3中A、B、C、D）。

圖2 LAMP檢測基因組的渾濁度觀察Fig.2 Turbidity observation of LAMP method for genomic DNA

2.3 LAMP檢測創(chuàng)傷弧菌特異性試驗 按照1.2.2中的水煮法提取DNA，進行RTX和HA的LAMP特異性檢測，結果分別如圖4中A、B所示，除了創(chuàng)傷弧菌，9種其他細菌如沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、豬鏈球菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌、副溶血弧菌均未檢測到條帶，說明建立的LAMP檢測方法具有很好的特異性。

2.4 LAMP和PCR檢測人工污染食品樣品中創(chuàng)傷弧菌的檢出限比較 人工污染對蝦和貝類的創(chuàng)傷弧菌的濃度為108～101CFU/g，按1.2.5方法處理樣品提取DNA，分別進行LAMP和常規(guī)PCR檢測RTX的檢出限試驗。對蝦貝類勻漿液加入創(chuàng)傷弧菌后進行10倍系列稀釋，LAMP方法在其稀釋至10-6倍(102CFU/g)時能出現(xiàn)條帶，而稀釋到10-7倍 (101CFU/g )時不能檢測到創(chuàng)傷弧菌，不出現(xiàn)條帶，所以LAMP檢測RTX基因的最低檢測限為102CFU/g；PCR方法在勻漿液稀釋到10-5倍(103CFU/g)時能出現(xiàn)條帶，而稀釋到10-6倍（102CFU/g）時不能檢測到創(chuàng)傷弧菌，不出現(xiàn)沉淀, 所以PCR檢測RTX基因的檢測限為103CFU/g。

圖3 LAMP靈敏度檢測結果Fig.3 The results of sensitivity test of LAMP

圖4 LAMP特異性試驗結果Fig.4 The results of speci fi city test of LAMP

A：LAMP對基因組RTX特異性檢測結果; B：LAMP對HA特異性檢測結果; 1：DNA分子量標準(DL15 000); 2：創(chuàng)傷弧菌; 3：沙門氏菌; 4：大腸桿菌; 5：金黃色葡萄球菌; 6：腸球菌; 7：豬鏈球菌; 8：霍亂弧菌; 9：溶藻弧菌; 10：擬態(tài)弧菌; 11：副溶血弧菌

A：The results of LAMP speci fi city test for genomic RTX; B：The results of LAMP speci fi city test for genomic HA; 1：DNA Marker(DL15 000); 2：Vibrio vulnif i cus; 3：Salmonella; 4：Escherichia coli; 5：Staphylococcus aureus; 6：Enterococcus; 7：Streptococcus suis; 8：Vibrio cholera; 9：Vibrio alginolyticus; 10：Vibrio mimicus; 11：Vibrio parahemolyticus

以同樣的方法分別檢測LAMP和常規(guī)PCR對HA的檢出限。LAMP方法在對蝦貝類勻漿液稀釋到10-4倍（104CFU/g）時能出現(xiàn)條帶，而稀釋到10-5倍（103CFU/g）時不能檢測到創(chuàng)傷弧菌，不出現(xiàn)條帶，所以LAMP檢測HA基因的檢測限為104CFU/g；PCR方法在對蝦貝類勻漿液稀釋到10-4倍（1.0×104CFU/g）時能出現(xiàn)條帶，而稀釋到10-5倍（103CFU/g）時不能檢測到創(chuàng)傷弧菌, 不出現(xiàn)沉淀,所以PCR檢測HA基因的檢測限為104CFU/g 。

3 討論

創(chuàng)傷弧菌廣泛分布于海洋及海產品中，患病者一般誤食或經(jīng)傷口感染，臨床病癥主要表現(xiàn)為胃腸炎及傷口化膿壞死性病變，易引發(fā)敗血癥[13-15]，故成為全球重要的海洋致病細菌，與副溶血弧菌、霍亂弧菌并列為造成人類致病的三大弧菌。隨著人們對海產品需求的提高及海上運動的追求，接觸并感染創(chuàng)傷弧菌的病例越來越多。1996～2010年，美國累計報道1600余例，病死率達30%[16]。2003～2010年臺灣地區(qū)報道近100例，病死率高達60%[17]。

目前用于檢測創(chuàng)傷弧菌的方法有鑒定培養(yǎng)基、形態(tài)學等方法。這些傳統(tǒng)方法雖然不需要昂貴的儀器，但是耗時長、特異性和靈敏性太差[17]。熒光定量PCR檢測、常規(guī)PCR檢測和ELISA檢測雖然特異性和敏感性強，但是需要專業(yè)人員操作，需要的設備儀器比較昂貴，因此不利于在基層檢測進行推廣。為了人們食用海產品的安全性，需要建立一種快捷、簡便、實用性強的方法來滿足檢測需求。

圖5 LAMP和PCR方法對人工污染食品中創(chuàng)傷孤菌的靈敏度檢測結果Fig.5 The sensitivity of LAMP and PCR methods for the detection of isolated bacteria in arti fi cially contaminated food

LAMP是一種恒溫的核酸擴增技術，不但具有較好的特異性和靈敏度[18]，而且不需要十分昂貴的設備儀器，也不需要專業(yè)的技術人員進行操作，通過眼睛即可直接觀察結果。LAMP最大的優(yōu)點在于檢測時間短，能夠大大地降低檢測時間和成本[19]。本研究以創(chuàng)傷弧菌（ATCC27562）HA基因和RTX毒力基因的保守序列作為靶序列，分別設計內、外引物，建立快速檢測創(chuàng)傷弧菌的方法，并將兩段基因的檢測結果與普通PCR檢測結果進行比較，結果顯示其靈敏度不低于普通PCR檢測，同時比PCR耗時短。特異性檢測結果顯示建立的LAMP具有很高的特異性，并且可以直觀地通過眼睛觀察沉淀達到檢測的結果。目的菌DNA通過水煮法即可獲得，避免了購買DNA提取試劑盒，進一步降低了檢測成本。

本研究建立的LAMP檢測具有簡便、省時、特異性高、靈敏度好、判斷結果簡便、成本低等優(yōu)點，有利于在基層進行推廣應用。通過進一步的研究摸索，LAMP可成為檢測海產品安全的一種常規(guī)方法。

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ESTABLISHMENT OF LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION FOR DETECTION OF TWO VIRULENT GENES OF VIBRIO VULNIFICUS

BIE Chuang-nan1, WANG Quan2, BAI Xue-rui2, LING Jiao2, LI Gong-he1, JIANG Wei2

(1.Guangxi University,Nanning530005, China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China)

In the present study, we developed and validated a loop-mediated isothermal ampli fi cation (LAMP) assay for detection of two toxins genes of Vibrio vulnif i cus. The inner and outer primers of LAMP were designed based on the conserved sequences of V. vulnif i cus hemolysin gene A (HA) and repeats-in-toxin (RTX) virulent gene. The detection method was preliminary evaluated by formation of the white deposition and con fi rmed through agarose gel electrophoresis. The sensitivity of this detection method was 10 CFU/mL for two LAMP genes of V. vulnif i cus. This method showed good speci fi city to V. vulnif i cus as it did not react with any other bacterial species. The bacterial DNA was extracted by water-boiling method and it took 1.5 h from sample processing to obtaining results. The detection limits were 102CFU/g for RTX and 104CFU/g for HA. On the contrast, the detection limit of common PCR method was 103CFU/g for RTX and 104CFU/g for HA and it took 4 h to complete test. This LAMP method may be used for on-site diagnostics of V. vulnif i cus in the food and agricultural industries.

Loop-mediated isothermal ampli fi cation; hemolysin gene A; repeats-in-toxin; Vibrio vulnif i cus

S852.613

A

1674-6422（2017）06-0048-07

2017-04-11

上海市科學技術委員會科研計劃項目（17140900400）

別闖男，男，碩士，主要從事病原微生物的防控技術研究

蔣蔚，E-mail：jiangwei@shvri.ac.cn；李恭賀，E-mail：ligonghe@163.com