基于反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)金黃色葡萄球菌

梁玉林，劉秀，周振森，周鵬飛，尹建軍

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京， 100015)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是革蘭氏陽(yáng)性菌，是常見的食源性致病菌之一。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，食品受污染的機(jī)會(huì)很多，常見受其污染的食品有肉、奶、魚、蛋類及其制品等。進(jìn)食污染食品會(huì)引起食物中毒及肺炎、心包炎、敗血癥等疾病[3-5]。據(jù)美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，在全球范圍內(nèi)由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。因此，開發(fā)一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法來檢測(cè)金黃色葡萄球菌對(duì)食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控工作至關(guān)重要。

目前對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)主要是產(chǎn)致病性毒素金葡菌和耐甲氧西林金葡菌的檢測(cè)，通常采用細(xì)菌的分離培養(yǎng)、染色觀察、血漿凝固酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)和耐藥性檢測(cè)等，這些方法操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，靈敏性不高，不能滿足當(dāng)前快速檢測(cè)需求[6]。近年來以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法和以核酸為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)以其準(zhǔn)確性、快速性逐漸成為致病菌檢測(cè)方法的發(fā)展方向[7-8]。酶聯(lián)免疫(ELISA)法是免疫學(xué)中最常用的方法，SCHOTTE等[9]報(bào)道過一種改良ELISA方法，能夠在15 min內(nèi)檢測(cè)500 pg/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素。但該方法所用試劑選擇性高，價(jià)格昂貴，易受環(huán)境、時(shí)間、溫度等條件影響。以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為代表的變溫核酸擴(kuò)增方法最早在國(guó)外被應(yīng)用于致病菌檢測(cè)，WILSON等[10]采用該方法8 h內(nèi)可檢出人工污染脫脂乳中金黃色葡萄球菌腸毒素B和C1，對(duì)靶DNA檢測(cè)限達(dá)到1 fg。該方法雖然敏感、準(zhǔn)確、快速，但需要昂貴的的儀器設(shè)備，對(duì)檢測(cè)人員有較高的技術(shù)要求，限制了這些方法普及和推廣[11-12]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是日本學(xué)者NOTOMI等[13]在2000年發(fā)明的一種全新的核酸體外擴(kuò)增新技術(shù)。LAMP技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、速度快和設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[14-16]。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，不依賴任何專門的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于PCR。因DNA在死菌中不易降解，傳統(tǒng)的以DNA為檢測(cè)模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，可能會(huì)檢出死菌DNA而造成假陽(yáng)性的后果[17-18]。而RNA在死菌中易降解，以RNA為檢測(cè)模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)能夠避免假陽(yáng)性的發(fā)生。通過選取金黃色葡萄球菌特異性保守nuc基因并設(shè)計(jì)引物[19-21]，構(gòu)建了檢測(cè)該靶基因的實(shí)時(shí)熒光RT-LAMP技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌等26株細(xì)菌均為本實(shí)驗(yàn)室保存；溶菌酶，天根生物科技公司；RNeasy Minikit，QIAGEN公司；Isothermal Master Mix(IMM)，英國(guó)OptiGene Limited公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)，中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)，瓊脂糖凝膠，北京路橋技術(shù)股份有限公司；PrimeScriptTMRT-PCR Kit，寶生物工程(大連)有限公司；Trans DNA MarkerⅡ，全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微量移液器，德國(guó)Eppendorf公司；高壓滅菌鍋(SX-700)，日本TOMY公司；精密天平(CPA323S)，德國(guó)Sartorius公司；超純水儀(Mili-Q Advantage A10)，德國(guó)默克公司；離心機(jī)( 5804R型，5424型)，德國(guó)Eppendorf公司；超微量核酸蛋白分析儀(Biodrop)，英國(guó)柏點(diǎn)公司；GenieⅢ，英國(guó)OptiGene Limited公司；電泳儀(JY-300C)，北京君意儀器公司；凝膠成像儀，法國(guó)VILBER公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中的nuc基因(GenBank Accession BA000018.3)的序列，利用LAMP Primer Explorer 4在線軟件(http://primer explorer.jp/elamp4.0.0/index.htm l)設(shè)計(jì)5組引物，每組引物分別包括外引物F3、B3，內(nèi)引物FIP、BIP和環(huán)引物L(fēng)oopF，設(shè)計(jì)完成后委托北京六合華大基因科技有限公司合成。對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行初步篩選，避免引物間出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

1.3.2 純培養(yǎng)細(xì)菌RNA提取

在平板上取金黃色葡萄球菌單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h到對(duì)數(shù)期。取1 mL菌液5 000g離心10 min，輕輕倒掉液體。向沉淀加入10 μL蛋白酶K，100 μL TE(含終質(zhì)量濃度15 mg/mL溶菌酶)，充分混勻沉淀，在室溫下反應(yīng)30 min，后續(xù)步驟嚴(yán)格按照RNeasy Mini kit操作步驟提取。

1.3.3 RT-LAMP和RT-PCR反應(yīng)

經(jīng)優(yōu)化后在12.5 μL體系中，包括7.5 μL IMM、3.5 μL混合引物(外引物、內(nèi)引物和環(huán)引物含量分別為2.5 pmol、10 pmol和5 pmol)、1.5 μL模板。RT-LAMP反應(yīng)溫度65 ℃，反應(yīng)時(shí)間30～60 min。

RT-PCR擴(kuò)增引物nuc-F：5′-GCCCAATTCGTTATGACAGAATACT-3′，nuc-R：5′-CAAGTCGACCAGCTTGTCTTCGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為694 bp。按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit 操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

1.3.4 死菌中RNA降解實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證死菌中RNA降解情況，我們選取107、106、105、104、103、102、101CFU/mL七個(gè)菌液濃度。121 ℃下20 min高壓蒸汽滅菌，放置一段時(shí)間，模擬死菌狀態(tài)。分別對(duì)滅菌前后各濃度梯度的金黃色葡萄球菌菌液進(jìn)行RNA提取，并進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。

1.3.5 RT-LAMP反應(yīng)的特異性和靈敏度

提取本實(shí)驗(yàn)室的金黃色葡萄球菌等26株細(xì)菌RNA，進(jìn)行RT-LAMP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證建立的RT-LAMP方法的特異性。將提取的原菌液總RNA測(cè)定濃度后，對(duì)總RNA進(jìn)行稀釋，最后選取2 fg、20 fg、200 fg、2 pg、20 pg、200 pg、2 ng/μL共7個(gè)濃度梯度，從各濃度梯度各取1.5 μL作為反應(yīng)模板進(jìn)行RT-LAMP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)純培養(yǎng)金黃色葡萄球菌靈敏度。

1.3.6 RT-LAMP和RT-PCR反應(yīng)在人工污染脫脂乳樣品中的靈敏度檢測(cè)

為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，經(jīng)國(guó)標(biāo)GB/T4789.10—2016方法證實(shí)試驗(yàn)所用脫脂乳中不含金黃色葡萄球菌。取25 g脫脂乳置于225 mL滅菌生理鹽水中，制備脫脂乳勻漿。取新鮮培養(yǎng)的12 h細(xì)菌，用生理鹽水充分洗滌培養(yǎng)基，10倍梯度系列稀釋，取各稀釋度菌液1 mL加入脫脂乳勻漿中，制備人工污染脫脂乳勻漿，使人工污染脫脂乳勻漿中金黃色葡萄球菌含量達(dá)到10-1～105CFU/mL，充分混合，作為人工污染脫脂乳樣品。

取各菌液濃度的人工污染脫脂乳樣品1 mL，提取人工污染脫脂乳樣品中的RNA，同時(shí)取不加金黃色葡萄球菌的脫脂乳樣品1 mL作為陰性對(duì)照平行進(jìn)行RNA提取。以提取的RNA為反應(yīng)模板分別進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR實(shí)驗(yàn)，并對(duì)兩種方法的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

根據(jù)RT-LAMP引物設(shè)計(jì)原則，共設(shè)計(jì)了5組金黃色葡萄球菌引物。為驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物的穩(wěn)定性，在未存放過核酸樣品的實(shí)驗(yàn)室中，對(duì)5組金黃色葡萄球菌引物進(jìn)行RT-LAMP陰性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。由圖1可以看出，1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)引物均發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，可以斷定該擴(kuò)增反應(yīng)是非特異性的，可能是引物二聚體引起的擴(kuò)增反應(yīng)。在加入金黃色葡萄球菌核酸樣品情況下，對(duì)5組引物進(jìn)行RT-LAMP陽(yáng)性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。圖2表明，4號(hào)引物RT-LAMP反應(yīng)出現(xiàn)熒光曲線時(shí)間最短且熒光值最高。對(duì)比圖1和圖2可知，設(shè)計(jì)的4號(hào)引物無論是在引物穩(wěn)定性還是在擴(kuò)增時(shí)間、熒光值方面均最佳，因此選取4號(hào)引物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，4號(hào)引物序列如表1所示。

圖1 金黃色葡萄球菌引物篩選(不含檢測(cè)模板)Fig.1 Staphylococcus aureus primer selection (without detection template)

圖2 金黃色葡萄球菌引物篩選(含檢測(cè)模板)Fig.2 Staphylococcus aureus primer selection (with detection template)

表1 金黃色葡萄球菌靶基因引物序列

Table 1 Staphylococcus aureus target gene primer sequence

靶基因引物序列(5'-3')nucF3TTAAGTATAGACAATGGGGAGTB3AGCATCCATCATATATTTAGAGTTGFIPACAACGTCATCACCTGTACTTAATT-TTTATCATGCGATT-GATCGTGBIPCTACATCACCAGAAATTGGTACTGT-GCTACCACCTTCAACATCGLFGTTATTACCACCTTCACGTGCT

2.2 引物退火曲線分析

RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)是否發(fā)生一般通過凝膠電泳是否出現(xiàn)梯狀條帶判斷，而該方法并不能完全得出擴(kuò)增是由于體系中的金黃色葡萄球菌特異性靶基因片段存在的結(jié)論。為輔助分辨RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物來源，進(jìn)一步避免假陽(yáng)性的發(fā)生。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的GC含量不同，退火溫度不同的原理，對(duì)引物退火曲線進(jìn)行分析。如圖3所示，篩選的4號(hào)引物在退火溫度為82.5 ℃左右時(shí)，對(duì)應(yīng)的退火曲線出現(xiàn)峰值。

圖3 4號(hào)引物的退火曲線分析Fig.3 Annealing curve analysis of No.4 primer

2.3 死菌中RNA降解實(shí)驗(yàn)

DNA比較穩(wěn)定，在死菌中能長(zhǎng)時(shí)間存在，以DNA為檢測(cè)模板的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)可能會(huì)檢出死菌DNA而造成假陽(yáng)性的后果。而RNA不穩(wěn)定、易降解，不能在死菌中長(zhǎng)時(shí)間存在。應(yīng)用RNeasy Minikit試劑盒對(duì)同一濃度的金黃色葡萄球菌分別進(jìn)行滅菌前后菌液核酸提取，并進(jìn)行RT-LAMP實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證死菌中RNA的降解情況。結(jié)果表明，以滅菌前金黃色葡萄球菌菌液提取的核酸為檢測(cè)模板進(jìn)行RT-LAMP實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)限能達(dá)到101CFU/mL(如圖4)。

圖4 活菌RNA檢測(cè)Fig.4 RNA detection of viable bacteria

RNeasy Mini kit試劑盒對(duì)金黃色葡萄球菌的DNA和RNA均能有效提取，通過DNA消化去除DNA雜質(zhì)得到純的RNA。RT-LAMP反應(yīng)靈敏，反應(yīng)體系的IMM中含有反轉(zhuǎn)錄酶，可以使反轉(zhuǎn)錄過程和擴(kuò)增反應(yīng)過程同步進(jìn)行，在該體系中以金黃色葡萄球菌的DNA和RNA為檢測(cè)模板均能夠產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)。以滅菌后菌液提取的核酸為檢測(cè)模板進(jìn)行RT-LAMP實(shí)驗(yàn)，可能由于高濃度的菌液中DNA消化不完全導(dǎo)致檢測(cè)模板中含有DNA而檢出107CFU/mL的菌液濃度(如圖5)。因在實(shí)際樣品中最大也不會(huì)產(chǎn)生超過104CFU/mL的污染量，所以以RNA為檢測(cè)模板的RT-LAMP反應(yīng)能很好的鑒別金黃色葡萄球菌是否處于活菌狀態(tài)。

圖5 死菌RNA檢測(cè)Fig.5 RNA detection of dead bacteria

2.4 RT-LAMP反應(yīng)特異性和靈敏度

對(duì)金黃色葡萄球菌等26株細(xì)菌進(jìn)行RT-LAMP特異性檢測(cè)，只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生熒光擴(kuò)增反應(yīng)，其余非金黃色葡萄球菌均未產(chǎn)生熒光擴(kuò)增反應(yīng)(如表2)，說明建立的RT-LAMP方法具有較強(qiáng)的菌株特異性。

提取純培養(yǎng)金黃色葡萄球菌總RNA作為反應(yīng)模板，對(duì)模板進(jìn)行10倍系列稀釋，檢測(cè)純培養(yǎng)金黃色葡萄球菌RT-LAMP的反應(yīng)靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)核酸濃度20 fg/μL該方法仍能特異性檢出(見圖6)，所建立的實(shí)時(shí)熒光RT-LAMP方法比文獻(xiàn)報(bào)道的其他病原菌RT-LAMP反應(yīng)靈敏度至少要高一個(gè)數(shù)量級(jí)[22]。

2.5 RT-LAMP和RT-PCR反應(yīng)在人工污染脫脂乳樣品中的靈敏度檢測(cè)

將提取的人工污染脫脂乳RNA溶解到50 μL不含RNase的無菌水中，取其中1.5 μL為檢測(cè)模板，分別進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR實(shí)驗(yàn)(見圖7和圖8)。同時(shí)取1 mL各菌液濃度的人工污染脫脂乳樣品進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，記錄人工污染脫脂乳樣品中金黃色葡萄球菌的準(zhǔn)確含量。結(jié)合平板計(jì)數(shù)，人工污染脫脂乳樣品RT-LAMP靈敏度達(dá)到23 CFU/mL，換算成脫脂乳含菌量為230 CFU/g，并且30 min內(nèi)能完成檢測(cè)。與此同時(shí)，人工污染脫脂乳樣品RT-PCR靈敏度只能達(dá)到2.3×103CFU/mL，換算成脫脂乳含菌量為2.3×104CFU/g，比RT-LAMP檢測(cè)靈敏度低100倍。為進(jìn)一步判斷擴(kuò)增反應(yīng)是否由于體系中的金黃色葡萄球菌靶基因片段存在而引起，對(duì)人工污染脫脂乳樣品RT-LAMP退火曲線進(jìn)行分析。如圖9各菌液濃度的人工污染脫脂乳樣品RT-LAMP退火曲線特征峰的峰值均出現(xiàn)在82.5 ℃左右，跟RT-LAMP陽(yáng)性擴(kuò)增相一致。結(jié)果判定各菌液濃度的人工污染脫脂乳樣品RT-LAMP的擴(kuò)增反應(yīng)均是由于體系中金黃色葡萄球菌靶基因片段存在而引起的。所建立的方法從核酸提取到RT-LAMP反應(yīng)結(jié)束大概只需要1 h左右，大大減少了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，有望應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

表2 RT-LAMP反應(yīng)特異性

注：“+”表示有熒光擴(kuò)增曲線，“-”表示無熒光擴(kuò)增曲線。

圖6 RT-LAMP反應(yīng)靈敏度Fig.6 RT-LAMP reaction sensitivity

M-DNA分子質(zhì)量Marker; NC-陰性對(duì)照;1-2.3×105 CFU/mL; 2-2.3×104 CFU/mL;3-2.3×103 CFU/mL;4-2.3×102 CFU/mL;5-23 CFU/mL;6-2 CFU/mL;7-0 CFU/mL圖7 人工污染脫脂乳RT-LAMP反應(yīng)靈敏度Fig.7 Artificial contamination skim milk RT-LAMP reaction sensitivity

圖8 人工污染脫脂乳RT-PCR產(chǎn)物電泳Fig.8 Artificial contamination skim milk RT-PCR product electrophoresis

圖9 人工污染脫脂乳RT-LAMP反應(yīng)退火曲線Fig.9 Artificial contamination of skim milk RT-LAMP reaction Annealing curve

3 討論

在食品檢測(cè)中，由于死菌中DNA的長(zhǎng)期存在使得基因水平的檢測(cè)方法高估了樣品中的活菌的水平，造成假陽(yáng)性問題。在活菌檢測(cè)方面，前人做了大量工作。CHEN等[23]利用熒光染料疊氮溴化丙錠(PMA)與LAMP技術(shù)相結(jié)合來區(qū)分死菌和活菌。PMA是對(duì)DNA有高度親和力的熒光染料，不能透過完整的細(xì)胞膜，只能選擇性的透過不完整的死細(xì)胞，PMA與死菌DNA結(jié)合后使之不能發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)[24-25]。PMA-LAMP實(shí)驗(yàn)需要對(duì)PMA濃度和光照時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣。并且由于PMA對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌作用效果不一樣，而導(dǎo)致PMA對(duì)混合菌液作用效果不佳。相比而言RT-LAMP在活菌檢測(cè)中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，以致病菌RNA為檢測(cè)模板更能反映樣本中的活菌狀態(tài)。RT-LAMP技術(shù)在病毒檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，在食源性致病菌檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用較少。本研究將RNA檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)相結(jié)合，不但能夠鑒定細(xì)菌的死活，而且進(jìn)一步提高了反應(yīng)的靈敏度。

金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生一種與凝固酶相關(guān)的細(xì)胞外耐熱核酸酶，近來文獻(xiàn)報(bào)道多以編碼耐熱核酸酶的nuc基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)LAMP引物[26-29]。張璐等[30]在檢測(cè)的221株金黃色葡萄球菌中，發(fā)現(xiàn)99.09%含有nuc基因。本實(shí)驗(yàn)選取特異性保守nuc基因設(shè)計(jì)了5組引物，通過對(duì)不同組引物進(jìn)行篩選，構(gòu)建了基于RNA為檢測(cè)模板的實(shí)時(shí)熒光RT-LAMP技術(shù)體系。

綜上所述，本研究建立了簡(jiǎn)單、便捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高適用于脫脂乳的金黃色葡萄球菌RT-LAMP檢測(cè)方法。因受金黃色葡萄球菌污染的食品種類很多，不同食物基質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌核酸提取干擾情況不同，而實(shí)驗(yàn)只對(duì)人工污染脫脂乳樣品進(jìn)行了檢測(cè)，因此后期需要擴(kuò)大人工污染食品種類并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，逐步完善或推廣該技術(shù)的應(yīng)用。

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