長期攝入NDMA超標(biāo)臘腸對大鼠肝臟損害的研究

容敏賢，邱月升，王佩，王藝苑，鄧紅

（南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，廣東廣州510515）

臘腸、咸魚等動物性腌制食品是我國居民喜食的一類加工肉制品，但其食用安全性越來越引起人們的關(guān)注。2016年中國膳食指南提出[1]少吃煙熏和腌制肉制品的建議。2015年10月26日，國際癌癥研究機構(gòu)發(fā)表聲明[2]，將紅肉和加工肉制品分別列為很可能的致癌物（2A類）和致癌物（1類）。大量的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[3－7]，經(jīng)常吃動物性腌制食品會增加肝癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤的風(fēng)險，并分析很可能與 N－亞硝基化合物（N－nitroso compounds，NOCS）及其前體物、苯并芘（BaP）等致癌物質(zhì)攝入增加有關(guān)。早在1956年，Magee等[8]將二甲基亞硝胺（N－nitrosodimethylamine，NDMA）含量為 50 mg/kg的飼料喂養(yǎng)大鼠一年，幾乎全部發(fā)生肝癌，揭示了亞硝胺類物質(zhì)的致癌性；Nichols等[9]用NDMA超標(biāo)的咸魚喂養(yǎng)大鼠2年，發(fā)現(xiàn)實驗組肝癌發(fā)病率顯著高于喂食普通飼料組。

近年來，我國加強了對腌肉制品中NOCS及其前體物污染的監(jiān)測，有調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國市售臘腸及腌肉制品 NDMA 檢出率較高[10－13]，且含量超標(biāo)（＞3 μg/kg）現(xiàn)象不容忽視[13]；參照美國農(nóng)業(yè)部關(guān)于肉制品總揮發(fā)性亞硝胺限量標(biāo)準(zhǔn)（≤10 μg/kg），我國腌肉制品中總揮發(fā)性亞硝胺超標(biāo)也不容忽視[12－13]。目前，有關(guān)腌肉制品中NOCS及其前體物的研究主要集中在相關(guān)污染物的檢測方法建立、含量檢測及降低污染等方面，而NOCS及其前體物污染食品攝入后對機體健康危害報道很少，主要是流行病學(xué)研究結(jié)果，如Yun Zhu等的病例對照研究顯示，腌肉品中NDMA與結(jié)直腸癌的發(fā)生相關(guān)[14]；多項動物毒理學(xué)實驗證明，NDMA作用靶器官是肝臟、有強烈的肝臟毒性[15－16]，但長期攝入NOCS及其前體物污染腌肉制品對健康的危害尤其是肝臟的潛在危害報道很少。本研究采用長期臘腸喂養(yǎng)動物實驗，利用飲水中含NDMA建立長期低劑量攝入NDMA致大鼠肝臟損害模型（肝炎－肝纖維化－肝硬化－肝癌），比較同期攝入NDMA超標(biāo)與不超標(biāo)臘腸的大鼠肝臟損害情況，旨在研究長期攝入不同數(shù)量、不同NDMA污染程度臘腸對機體肝臟的損害，探索其損害機制，為我國腌制食品安全監(jiān)管以及膳食指導(dǎo)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（許可證號：SCXK（粵）2011－0015），平均體重（200.8±23.9）g。

1.1.2 主要試劑與儀器

二甲基亞硝胺（N－nitrosodimethylamine，NDMA，99.0%分子式C2H6N20）：TCl（Tokoyo）公司；4%多聚甲醛：北京索萊寶（Solarbio）科技有限公司；水合氯醛（分析純）；血清總蛋白（Total protein，TP）、白蛋白（Albumin，ALB）、天門冬氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酶氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）：南京建成生物工程研究所；TGL－16MS臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；Epoch2微孔 板 分 光 光 度 計 ：BioTek Instruments，Inc.USA；UV752（UV752N）紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；OLYMPUSVANOX PM－10AD型顯微照相儀：日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及飼養(yǎng)

207只雄性SD大鼠飼養(yǎng)在SPF級動物實驗室中，12 h晝夜循環(huán)，室溫（20±2）℃，相對濕度 40%～60%，3只/標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，實驗動物隨機分為三大組：普通飼料對照組（control group，CON）33只，NDMA造模組75只和臘腸組（Sausage，S）99只。臘腸組又分為3個亞組，分別為18%普通臘腸對照組（S1組）、18%臘腸NDMA超標(biāo)組（S2組）和36%臘腸NDMA超標(biāo)組（S3組），每組各33只。除采血和處死前12小時禁食外，大鼠自由獲取食物和飲水。

1.2.2 飼料配制

在綜合考慮營養(yǎng)成分以及加工方式具有可比性的基礎(chǔ)上，選擇兩種臘腸NDMA的含量分別為7.37 μg/kg（超過我國食品安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)3 μg/kg[17]）和1.13 μg/kg（未超標(biāo)）制作大鼠飼料。根據(jù)文獻[18]，用含1.13 μg/kg NDMA的臘腸加工制作了含18%臘腸的1號飼料，用含7.37 μg/kg NDMA的臘腸分別制作了含18%臘腸的2號飼料和含36%臘腸的3號飼料。這3種飼料與AIN-93G飼料在營養(yǎng)成分上無明顯差別（表1）。飼料委托廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心制作，真空包裝，鈷60輻照滅菌，4℃避光冷藏保存。實驗過程中，CON組和NDMA組給予AIN-93G標(biāo)準(zhǔn)飼料，S1組、S2組、S3組分別給予1、2、3號飼料，連續(xù)飼養(yǎng)33周，每天記錄大鼠的飲水量，每周稱量體重和攝食量，并做好記錄。

表1 大鼠飼料配方/100 gTable 1 Ingredients of rat diets per 100 g

1.2.3 NDMA造模及實驗大鼠肝臟損害研究

NDMA造模組利用飲用含NDMA的飲用水，建立實驗大鼠肝臟損害模型。根據(jù)預(yù)實驗，給予含30 μg/kg的NDMA飲用水，成功建立實驗大鼠從肝炎、肝纖維化、肝硬化直至肝癌的動物模型。

臘腸組和CON組整個實驗過程均給予滅菌自來水；NDMA組給予含30 μg/kg NDMA飲用水，任其自由飲用12周后改為滅菌自來水。NDMA組分別在2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32 周時各處死 3 只大鼠，進行病理檢查并根據(jù)病理結(jié)果，在NDMA組大鼠出現(xiàn)肝炎-肝纖維化-肝硬化-肝癌時（圖2），分別立即處死同期飼養(yǎng)的臘腸組和CON組大鼠各8只，收集肝臟組織檢查。

1.2.4 肝功能生化指標(biāo)檢測

在實驗過程中，分別在第7、17、25、33周時每組各處死大鼠8只。大鼠空腹12h，在10%水合氯醛（0.4mL/100g體重）麻醉下經(jīng)腹主動脈采血，室溫靜置1 h~2 h后，3 500 r/min離心15 min，取上清于EP管-80℃保存?zhèn)溆谩P、ALB、AST、ALT、ALP 肝功能生化指標(biāo)根據(jù)試劑盒說明進行測定，其中球蛋白（GLB）含量=TP-ALB。

1.2.5 病理學(xué)檢查

摘取肝臟組織，肉眼觀察肝臟有無顏色變化、充血、水腫、硬化、癌結(jié)節(jié)等病變，并進行肝臟稱重；剪取肝組織及腫瘤樣本1 cm×1 cm大小塊置于4%的多聚甲醛溶液中，固定24 h，石蠟包埋，制備5 μm切片，HE染色，光鏡下觀察大鼠肝臟組織病理變化。參照史黛絲·E·米爾斯等[19]編寫的病理醫(yī)生實用組織學(xué)（第四版）里面的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)進行半定量定性分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

利用Excel建立數(shù)據(jù)庫，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析，進行組間兩兩比較，方差齊時采用LSD-T檢驗法，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠一般情況

實驗期間，除NDMA組，CON組和各臘腸組大鼠的飲水、攝食正常，無脫毛、上呼吸道感染等不良狀況。NDMA組大鼠在實驗期間攝食量、飲水量及體重變化較其他4組不同，3周之后，其飲水量低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在31周之后，其攝食量顯著低于其他各組（P＜0.05）（結(jié)果未列出）。喂養(yǎng)至第16周，NDMA組大鼠的體重顯著低于CON組和各臘腸組（P＜0.01）；CON組和各臘腸組大鼠在整個喂養(yǎng)期間體重增長符合規(guī)律，各組體重?zé)o差異（圖1），說明喂食臘腸飼料對大鼠的體重影響不大。

2.2 NDMA造模組肝臟檢查結(jié)果

圖1 不同時間段各實驗組大鼠的體重Fig.1 Body weights of rats were measured during the experiment

在NDMA組大鼠病理檢查出現(xiàn)典型肝炎（7周）、肝纖維化（17周）、肝硬化（25周）以及肝癌階段（33周）。肉眼觀察肝臟，分別為表面光滑、色紅、質(zhì)地稍硬見圖2 A-1；肝臟腫大、色暗紅、質(zhì)地變硬見圖2 A-2；出現(xiàn)數(shù)量不等、大小不一的小米粒大小黃白色斑點樣病灶圖2 A-3以及在肝癌（33周）階段可見散在大小不等的灰白色癌結(jié)節(jié)，直徑大小約為1 cm~1.5 cm圖2 A-4。

大鼠肝臟典型病理切片結(jié)果見圖2 B。肝炎期（7周）匯管區(qū)及肝小葉內(nèi)較多淋巴細胞浸潤，少量肝細胞溶解性壞死（圖2 B-1）；肝纖維化期（17周）可見多個肝細胞嗜酸性及溶解性壞死，匯管區(qū)及肝小葉內(nèi)較大量淋巴細胞浸潤并可見纖維組織增生（圖2 B-2）；肝硬化期（25周）形成肝細胞增生結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)內(nèi)肝細胞異型性較小，有典型假小葉結(jié)構(gòu)，伴有肝細胞索排列紊亂，肝細胞變性、壞死，小葉中央靜脈缺如（圖2 B-3）；肝癌期（33周）可見出現(xiàn)癌細胞分化較好，呈梁索狀或團塊型排列，邊界不清，向周圍肝組織浸潤，部分區(qū)域出血、壞死，癌細胞呈現(xiàn)多形性，異型性明顯（圖2 B-4）。病理結(jié)果顯示NDMA誘導(dǎo)肝臟損傷模型造模成功。

圖2 不同時間段NDMA模型組大鼠肝臟大體觀察及病理切片圖Fig.2 General observation and pathological section of liver tissue of NDMA model rats at different time

2.3 長期攝入臘腸對大鼠肝臟組織的影響

2.3.1 肝功能生化指標(biāo)分析

血清中 TP、ALB、AST、ALT、ALP 等指標(biāo)是衡量肝功能重要指標(biāo)。ALB主要由肝細胞合成，血清ALB含量降低提示可能存在肝功能受損；由于肝臟有很強的代償能力以及ALB半衰期較長等原因，只有當(dāng)肝臟損害達到一定程度時才能并發(fā)血清TP、ALB的變化，因此血清TP和ALB檢測大都用在反映慢性肝損害，并可反映肝實質(zhì)細胞的儲備功能見圖3。

圖3 各實驗組大鼠血清生化指標(biāo)水平Fig.3 The level of different serum chemistry parameters of each group during the experiment

由圖3可知，與同期喂養(yǎng)的CON組相比，S2、S3、NDMA 組大鼠血清ALB顯著下降（P＜0.05），NDMA組顯著TP下降（P＜0.001）；而隨臘腸喂養(yǎng)時間延長，同組大鼠血清TP表現(xiàn)為下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

AST、ALT、ALP 均是細胞中的胞質(zhì)酶，AST、ALT主要存在于肝細胞內(nèi)，ALP來源廣泛，以肝細胞中最多。當(dāng)肝細胞受損時，AST、ALT、ALP釋放到血液里中，導(dǎo)致AST、ALT、ALP水平升高，尤其ALT水平，可以比較敏感地監(jiān)測到肝臟是否受到損害。由圖3可知，與同期喂養(yǎng)的CON組相比，臘腸喂養(yǎng)組AST、ALT呈增加趨勢，且7周，S3大鼠血清AST、ALT顯著增加（P＜0.05）；在第 33 周，大鼠血清 AST、ALT、ALP 從 CON→S1→S2→S3依次升高，但差異不顯著（P＞0.05）；各檢測時間點NDMA組的AST、ALT、ALP均顯著增加（P＜0.05）。以上結(jié)果提示肝細胞可能存在一定程度的損傷，尤其是NDMA組，肝細胞受損嚴(yán)重，該結(jié)果與后面的病理結(jié)果相一致。

2.3.2 肝臟指數(shù)及大體標(biāo)本觀察

動物臟器指數(shù)反映受試動物的營養(yǎng)狀況和內(nèi)臟變化情況。與CON組相比，NDMA組大鼠的肝臟指數(shù)在肝炎（7周）、肝纖維化階段（17周）變化不大，但進入肝硬化（25周）和肝癌期（33周）顯著低于其他四組，且隨著喂養(yǎng)時間延長，肝臟指數(shù)減小，提示NDMA對大鼠肝臟的損害加重；各臘腸組大鼠的肝臟指數(shù)與CON組相比無明顯差異見表2。

表2 各實驗組大鼠肝臟指數(shù)變化Table 2 The liver coefficients of each group during the experiment

肝臟肉眼觀察，CON組及S1組在整個實驗期間肝臟顏色和形態(tài)正常；隨著喂養(yǎng)時間延長，S2組、S3組大鼠肝臟體積增大，飽滿圓鈍，質(zhì)地稍硬；第25周觀察到S2組肝臟質(zhì)地變硬，色暗紅，且S3組變化較S2組明顯。提示S2組、S3組大鼠肝臟可能存在損害，具體情況需進一步病理檢查。

2.3.3 病理檢查結(jié)果

2.3.3.1 肝臟病理切片光鏡觀察

顯微鏡檢結(jié)果顯示，CON組肝組織形態(tài)均基本正常，僅在第33周出現(xiàn)部分肝小葉少量淋巴細胞浸潤（圖4 A）。而NDMA組隨著實驗進程，肝臟出現(xiàn)相應(yīng)的病理改變（具體結(jié)果見2.2及圖2 B）。

臘腸喂養(yǎng)組大鼠的肝臟病理改變與臘腸喂養(yǎng)時間、臘腸中NDMA的污染程度及攝入NDMA量等有關(guān)。S1組在第7周、17周未見病理改變（圖4 B－1、B－2），在第25周出現(xiàn)輕微炎癥改變，肝血竇輕微擴張，匯管區(qū)及肝小葉內(nèi)極少量淋巴細胞浸潤（圖4 B－3）；同期的S2組大鼠肝臟病理改變比S1組嚴(yán)重，出現(xiàn)了典型的肝炎，肝血竇中度擴張，匯管區(qū)及肝小葉內(nèi)少量淋巴細胞浸潤，個別細胞水腫（圖4 C－3），而S3病理改變更重，出現(xiàn)了肝細胞脂肪變性、匯管區(qū)及肝小葉周圍纖維組織增生（圖4 D－3）。進入第33周，S3組肝臟病理損害進一步加重，出現(xiàn)大量肝細胞脂肪變性和匯管區(qū)、肝小葉淋巴細胞浸潤，大量匯管區(qū)及肝小葉周圍纖維組織增生（圖4 D－4），但整個實驗周期（33周）未觀察到肝癌病理改變。

圖4 各組在不同實驗階段大鼠肝病理學(xué)觀察（光鏡下），HE染色（×400）Fig.4 Pathological observation of each group at different experimental stages（light microscope），HE staining（×400）

2.3.3.2 肝臟組織病理切片評分

根據(jù)病理診斷標(biāo)準(zhǔn)[19]進一步對肝臟病理結(jié)果進行半定量定性分析，肝炎評分、肝纖維化評分越高，肝臟受損程度越嚴(yán)重。從表3可以看出，從S1組→S2組→S3組→NDMA組，同期肝炎評分增加，并隨實驗時間增加而增高；S2、S3、NDMA組從第7周開始，各個時間點的肝炎評分顯著高于同期的CON組（P＜0.05）（表3）。S1組僅在第33周稍高于CON組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表3），提示盡管S1組大鼠飼料中添加臘腸中NDMA不超標(biāo)，但臘腸在腌制、煙熏或者高溫加熱過程中還可能產(chǎn)生亞硝胺之外的其他有害物質(zhì)，如苯并芘（BaP）、雜環(huán)胺、過氧化物[20]等，也可能導(dǎo)致機體尤其是肝臟損害，因此，腌肉制品不宜長期食用。NDMA組肝纖維化評分最高，自第17周顯著高于CON組；臘腸組僅S3組呈增高趨勢，在第33周高于CON組 （P＜0.05）；S1、S2組在整個實驗間肝纖維化評分接近0分（P＞0.05）。

肝炎、肝纖維化評分結(jié)果提示，臘腸喂養(yǎng)時間、臘腸中NDMA的污染程度、NDMA攝入量與大鼠的肝臟損傷密切相關(guān)。長期臘腸攝入對大鼠肝臟造成損傷主要由于攝入過量的NDMA所致，隨著NDMA污染臘腸攝入時間的延長，大鼠肝臟的損害加重。

表3 第7、17、25、33周各組大鼠肝組織病理切片評分情況Table 3 Pathological score of rat liver tissue of each group after feeding 7，17，25，33 weeks

3 結(jié)論

本研究采用長期喂養(yǎng)大鼠NDMA含量不同的3種臘腸飼料33周，觀察長期攝入臘腸對大鼠肝臟的病理損害。結(jié)果顯示，NDMA造模組分別在第7、17、25、33周觀察到大鼠肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌的肝臟損傷特征，提示NDMA誘導(dǎo)肝臟損傷模型成功。長期臘腸攝入對大鼠一般狀況以及肝臟指數(shù)影響不大，但對血清 TP、ALB，AST、ALT、ALP 水平有一定影響，并與同期肝臟病理檢查結(jié)果基本一致。整個33周實驗期間S1組肝臟病理改變不明顯，但第25周S2組出現(xiàn)了典型的肝炎病變，而同期S3組出現(xiàn)了肝纖維化病變，至第33周S3組肝臟病理損害進一步加重。肝炎評分從S1組→S2組→S3組→NDMA組增高，且各組的肝炎評分隨實驗時間增加而增高，S2、S3組從第7周開始，各個時間點的肝炎評分顯著高于同期的CON組。

本研究結(jié)果提示，長期攝入NDMA污染臘腸導(dǎo)致大鼠肝臟損害，損害程度與臘腸中NDMA是否超標(biāo)及喂養(yǎng)時間有關(guān)，該結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)研究報道一致，應(yīng)加強對腌肉制品中NOCs污染的安全監(jiān)管。本研究為進一步探索腌制食品與肝損傷機制提供了實驗依據(jù)。

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