離子色譜法測定嬰幼兒米粉中硝酸鹽和亞硝酸鹽

鄭小玲，郭小喜，李曉華，張舸，胡鑫，鄒瓊

（1.重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，重慶600020；2.山西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，山西太原030024）

隨著人們生活水平的提高，嬰幼兒米粉的品種及需求量日益增大，而嬰幼兒體質(zhì)較差，腸道微生物還原作用較強，易發(fā)生腸原性青紫病，即亞硝酸鹽中毒。硝酸鹽和亞硝酸鹽對嬰幼兒的危害遠大于成人[1-4]。在GB 10769-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒谷類輔助食品》[5]中規(guī)定嬰幼兒米粉中硝酸鹽（以硝酸鈉計）殘留量限量為100 mg/kg，亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）殘留量限量為2 mg/kg。鑒于在嬰幼兒米粉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的限量較低，且對嬰幼兒的危害較大，建立靈敏度高和準(zhǔn)確性好的方法，有利于企業(yè)在生產(chǎn)過程對于嬰幼兒米粉的質(zhì)量控制和市場產(chǎn)品監(jiān)管檢測。

在實際工作中，由于嬰幼兒米粉的特殊性，基質(zhì)成分相對復(fù)雜，樣品中含有淀粉，極易糊化。GB 5009.33-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[6]適用于食品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的測定，涉及食品種類廣泛，但是對于米粉基質(zhì)并不適用。按GB 5009.33-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》的前處理方法在實際操作中遇到前處理液粘稠不宜過濾，并且過濾后濾液渾濁，濾液過固相萃取小柱非常困難等問題。查閱文獻資料，只有采用比色法測定米粉中亞硝酸鹽的研究[2，4]，比色法靈敏度及重復(fù)性較差，暫無米粉中硝酸鹽測定的研究。本方法優(yōu)化了國標(biāo)中的前處理方法，結(jié)合在線過濾技術(shù)凈化樣品，解決上述問題，實現(xiàn)對嬰幼兒米粉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的定性定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙酮（色譜純）、Ag柱（1 mL）、Na柱（1 mL）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；冰醋酸（色譜純）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；碳酸鈉（基準(zhǔn)試劑）：北京化學(xué)工業(yè)集團有限責(zé)任公司；硝酸鈉標(biāo)液（1 000 mg/L）、亞硝酸鈉標(biāo)液（1 000 mg/L）：美國阿酷標(biāo)品公司；水為GB/T 6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水；C18小柱：美國色譜科公司，3 mL/500 mg；10 mL注射器：岳陽明康醫(yī)用材料有限公司；0.22 μm水性濾膜：天津津騰實驗設(shè)備有限公司；市售嬰幼兒配方米粉和跨境電商平臺抽檢嬰幼兒配方米粉各50份。

1.2 儀器與設(shè)備

離子色譜940：瑞士萬通中國有限公司；MX-F冷凍高速離心機：德國西格瑪公司；BS224S電子天平：德國賽多利斯斯泰帝（上海）貿(mào)易有限公司；KQ-500E超聲儀：昆山舒美公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：德國默克密理博公司。

1.3 試驗過程

稱取均勻試樣4 g，置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加40 mL超純水，搖勻，超聲30 min，取出放置室溫，加入3%乙酸溶液2 mL，混勻。于4℃放置20 min，取出離心 10 000 r/min，15 min。取上清液約 15 mL，C18柱、Ag柱和Na柱，棄去前面7 mL，收集后面洗脫液，通過0.22 μm水性濾膜針頭過濾器，進樣測試。固相萃取小柱使用前需活化，C18依次用10 mL甲醇和10 mL超純水通過，靜置活化30 min。Ag柱和Na柱用10 mL超純水通過，靜置活化30 min。

1.4 色譜條件

陰離子色譜分析柱為Metrosep A7-250（250 mm×4 mm）；保護柱 MetrosepASupp4/5Guard（5mm×4mm）；柱溫 45 ℃；進樣體積 100 μL，流速為 0.7 mL/min；淋洗液2.5 mmol/L NaCO3+5%丙酮。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

準(zhǔn)確移取亞硝酸根離子（以NO2-計）標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL和硝酸根離子（以NO3-計）標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL于1 000 mL容量瓶中，用水稀釋定容，亞硝酸根離子濃度為 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/L，硝酸根離子濃度為 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/L。以濃度對峰面積做曲線，計算相關(guān)系數(shù)。試樣加標(biāo)后，平行測定6次，計算結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和方法回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 稱樣量的選擇

由于嬰幼兒米粉中添加了多種營養(yǎng)物質(zhì)，基質(zhì)復(fù)雜，干擾較多，選擇合適的稱量樣對試驗有一定影響。由于實驗室過程中前處理只是簡單沉淀蛋白質(zhì)，除去大分子物質(zhì)，主要還得通過色譜柱分離目標(biāo)物。如果稱樣量較大，樣品糊化極為嚴(yán)重，雜質(zhì)干擾目標(biāo)峰。如果稱樣量較小，則達不到檢測要求的靈敏度。研究考察了 0.5、1.0、2、4、6、8 g 這 6 個稱樣量，對比不同稱樣量樣品的色譜圖，參考峰形、分離度、靈敏度和基線，結(jié)果顯示稱樣量4 g效果最佳。

2.1.2 沉淀劑的選擇

通常采用有機溶劑、酸沉淀、加熱變性和重金屬沉淀等方法去除蛋白質(zhì)。由于嬰幼兒米粉樣品基質(zhì)復(fù)雜，采用有機溶劑容易在過C18小柱時將雜質(zhì)物質(zhì)洗脫。采用加熱變性法不適用于米粉，因為米粉極易糊化，且沉淀效果較差。采用重金屬沉淀，如常用的乙酸鋅、亞鐵氰化鉀沉淀蛋白質(zhì)，會引入大量鋅、鉀、鐵離子污染色譜柱，降低離子色譜柱效，影響色譜柱壽命。試驗表明，采用3%的乙酸沉淀蛋白質(zhì)效果最佳，雜峰相對較少。

2.1.3 樣液分離及初步凈化

本方法采用50 mL離心管進行沉淀，比國標(biāo)方法中采用100 mL容量瓶簡易，方便批量操作。由于米粉含有淀粉，容易糊化，采用濾紙過濾的方法根本不適用，本方法采用低溫離心分離樣液。上清液依次過C18柱、Ag柱和Na柱凈化。由于樣品中氯離子含量較高，使用Ag柱出去氯離子，避免過量的氯離子干擾亞硝酸根的測定。

2.1.4 在線超濾

嬰幼兒米粉基體復(fù)雜，成分復(fù)雜，除含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)外，還添加了多種食品添加劑。過固相萃取小柱后的樣液仍不太澄清，稍渾濁。但離子色譜所分析的樣液要求嚴(yán)格，樣品不得含有顆粒物，因為這些顆粒將堵塞并最終損壞分離柱。本方法采用英蘭超濾技術(shù)，即在進樣口前加一個0.22 μm的在線英蘭超濾系統(tǒng)，可以直接處理懸濁液的樣品。該技術(shù)將大分子物質(zhì)、大顆粒物質(zhì)轉(zhuǎn)移，防止其損壞分離柱，堵塞管路。該法采用在線英蘭超濾技術(shù)有效保護分離柱，并減小干擾，操作簡單。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 淋洗液的選擇

淋洗液的濃度對陰離子的分離影響較大，試驗比較了Na2CO3和NaHCO3不同濃度的淋洗液。參考文獻的幾種淋洗濃度[7-12]，分別用2.5 mmol/L NaCO3-0.5 mmol/L NaHCO3、3.0 mmol/L NaCO3-0.8 mmol/L NaHCO3、3.2 mmol/L NaCO3-1.0 mmol/L NaHCO3、2.0 mmol/L NaCO3-5%丙酮、2.5 mmol/L NaCO3-5%丙酮、3.0 mmol/L NaCO3-5%丙酮做淋洗液。檢測同一標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果表明在2.5 mmol/L NaCO3-5%丙酮條件下背景電導(dǎo)率較小，硝酸鹽和亞硝酸鹽的分離效果最好。該法向淋洗液中加入適量丙酮，可有效改善分離效果，與雜質(zhì)峰完全分離。靈敏度高，分析時間符合要求。故本文選用2.5 mmol/L NaCO3-5%丙酮做淋洗液，待測組分可完全分離，如圖1~圖4所示。

該法在沉淀蛋白質(zhì)時引入了乙酸，亞硝酸根和硝酸根離子與其完全分離，不影響檢測結(jié)果。嬰幼兒米粉基質(zhì)組成復(fù)雜，亞硝酸根和硝酸根離子洗脫后還需要高濃度的40 mmol/L NaCO3-5%丙酮清洗色譜柱。

2.2.2 進樣量的選擇

圖1 亞硝酸鹽和硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)溶液離子色譜分析譜圖Fig.1 The ion chromatogrephy chromatogram of NO2-and NO3-standard sample

圖2 空白試劑色譜圖Fig.2 Blank reagent chromatogram

圖3 米粉樣品色譜圖Fig.3 Baby rice flour sample chromatogram

圖4 米粉樣加標(biāo)色譜圖Fig.4 Baby rice flour spiked sample chromatogram

由于樣品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量通常是痕量的，亞硝酸鹽含量限量為2 mg/kg，對于儀器的靈敏度要求較高。樣品的進樣量對于色譜的分離有一定的影響。加大進樣量可以提高樣品的靈敏度。但是樣品進樣量過大又會造成色譜柱過載，雜質(zhì)峰和溶劑峰過大，影響待測物質(zhì)的分離效果。考察了25、50、100、200、500 μL這 5種進樣量，從分離效果、峰形、峰面積、基線等方面比對，考察色譜圖，發(fā)現(xiàn)在100 μL的進樣量時，色譜峰峰形較好，對稱性較好，靈敏度高，基線平穩(wěn)，噪音小。

2.3 線性范圍

按1.4所述試驗方法配置硝酸根和亞硝酸根離子的混合標(biāo)液。按色譜條件對混合標(biāo)液進行測定。當(dāng)硝酸根離子濃度為0.1 mg/L~2.0 mg/L，亞硝酸根離子濃度為0.01 mg/L~0.20 mg/L時，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。以峰面積A（μS×min）對檢測組分質(zhì)量濃度Q（mg/L）作線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)（R）如表1所示。

2.4 最低檢出限

以基線噪聲的3倍所相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度計算，本法測定硝酸鹽（以NO3-計）最低檢出濃度為0.2mg/kg，亞硝酸鹽（以NO2-計）最低檢出濃度為0.1 mg/kg，低于國家標(biāo)準(zhǔn)方法的最低檢出濃度。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear equation and correlation coefficient

2.5 方法重現(xiàn)性及回收率

國內(nèi)外現(xiàn)暫無米粉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的基準(zhǔn)物質(zhì)。本方法選擇3個添加水平進行試樣加標(biāo)回收率試驗，以此方法平行測定6次，對測定結(jié)果的重現(xiàn)性，進行統(tǒng)計學(xué)處理。6次測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和平均回收率結(jié)果見表2。

表2 樣品加標(biāo)回收率（n=6）Table 2 Recovery rate of standard additions（n=6）

續(xù)表2 樣品加標(biāo)回收率（n=6）Continue table 2 Recovery rate of standard additions（n=6）

相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%~2.4%，小于5%，回收率結(jié)果在90.0%~96.0%之間。試驗證明，本方法的準(zhǔn)確度和精密度達到定量分析要求。

2.6 常見陰離子的干擾

在本試驗色譜條件下，常見陰離子F-、Cl-、SO42-的保留時間分別為6.2、8.7、23.1 min。這幾種離子均不干擾硝酸鹽和亞硝酸鹽的測定。蛋白沉淀劑引入的乙酸也與硝酸根和亞硝酸根離子完全分開。

2.7 實際樣品的測定及回收率

對重慶市市售和跨境電商的50份的不同品牌的嬰幼兒米粉進行監(jiān)測檢驗，每份樣品測定3次，回收測定2次，取平均值，部分結(jié)果見表3。

表3 15份加標(biāo)硝酸鹽和亞硝酸鹽測定值和回收率Table 3 NO2-and NO3-value and recovery rate of 15 samples

米粉中亞硝酸鹽（以NO2-計）濃度為未檢出~0.4mg/kg，硝酸鹽（以 NO3-計）濃度為 5.2 mg/kg~18.7 mg/kg，這50份米粉中亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量均小于限量標(biāo)準(zhǔn)。亞硝酸鹽回收率為89.5%~96.0%，硝酸鹽回收率為89.8%~96.1%，表明本方法準(zhǔn)確度較高，適用于嬰幼兒米粉中亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的測定。

3 結(jié)論

嬰幼兒是國家和民族的希望，嬰幼兒米粉的安全備受關(guān)注。嬰幼兒米粉成分復(fù)雜，除含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物之外，還添加多種食品添加劑，如維生素、糖類、無機鹽等，本方法采用離心分離樣液，過柱后采用在線英蘭超濾技術(shù)，解決了樣品前處理液粘稠及過濾后樣液不澄清等技術(shù)問題。結(jié)果表明，本方法高效、靈敏度高、檢出限低、重復(fù)性好等特點，適用于大批量的嬰幼兒米粉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的測定，對嬰幼兒米粉的質(zhì)量控制和政府部門的安全監(jiān)控具有重大意義。

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