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      半胱氨酸/納米金修飾電極差分脈沖伏安法測(cè)定蘆丁

      2018-02-28 02:11:46黃玉斌嚴(yán)春榮王齊
      食品研究與開發(fā) 2018年4期
      關(guān)鍵詞:伏安蘆丁微粒

      黃玉斌,嚴(yán)春榮,王齊

      (1.玉溪市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心,云南玉溪653100;2.昆明理工大學(xué)分析測(cè)試研究中心,云南昆明650000;3.云南省分析測(cè)試中心,云南昆明650000)

      蘆?。≧utin)又名蕓香苷,普遍存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子中,是一種具有生物活性的重要黃酮類物質(zhì)[1]。其分子中的α、β不飽和吡喃酮是各種生物活性的關(guān)鍵基團(tuán),而A、B、C三環(huán)的各種取代基則決定了其特定的藥效作用,從而決定了其不同生物活性。經(jīng)過大量的研究表明,蘆丁具有抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗癌抗腫瘤、抑制醛糖還原酶活性和治療毛細(xì)血管通透性增高引起的出血癥等功效,并且對(duì)器官缺血損傷也有保護(hù)與修復(fù)作用[2]。蘆丁的以上性質(zhì),使其成為許多中成藥試劑或保健食品的重要性指標(biāo)組分,因此研究簡(jiǎn)便、快捷、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法具有實(shí)際意義。蘆丁分子結(jié)構(gòu)式見圖1。

      圖1 蘆丁分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of rutin

      目前蘆丁的檢測(cè)方法主要是高效液相色譜法和分光光度法,其中高效液相色譜法是一種比較準(zhǔn)確的分離、定量測(cè)定方法[3-4],但是其具有龐大的色譜分離系統(tǒng)、較高儀器與試劑成本的缺點(diǎn);而紫外分光光度法在實(shí)際樣品測(cè)定中,經(jīng)常會(huì)受到共存還原性組分或樣品自身空白的影響,使測(cè)定結(jié)果比實(shí)際含量偏高30%~100%以上[5]。如何簡(jiǎn)便、高效地對(duì)復(fù)雜體系中蘆丁含量進(jìn)行定量分析,成為分析工作者的難題。近十年來,電化學(xué)分析法利用物質(zhì)在特定電極上氧化還原電位的不同,建立起了多種測(cè)定微、痕量物質(zhì)的方法,如循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法、溶出伏安法等[6-10],在未對(duì)物質(zhì)進(jìn)行預(yù)分離的情況下,這些方法對(duì)復(fù)雜體系中某一組分的定量測(cè)定有很好的效果。

      本研究利用半胱氨酸分子在金表面和金納米的自組裝性質(zhì),制備了一種多層結(jié)構(gòu)的修飾電極,研究了蘆丁分子在修飾電極上的電化學(xué)性質(zhì),并利用蘆丁分子在修飾電極上的差分脈沖伏安響應(yīng)信號(hào),建立了一種高靈敏度測(cè)定蘆丁含量的方法。

      1 材料與方法

      1.1 儀器與試劑

      CHI660C電化學(xué)工作站、電化學(xué)測(cè)量采用三電極體系、金圓盤電極(φ=2mm)、飽和甘汞參比電極、鉑絲輔助電極:美國(guó)CHI公司;Milli-Q Element超純水系統(tǒng):美國(guó)Millipore公司;SK3300H超聲波清洗儀:中國(guó)科導(dǎo)公司。

      L-半胱氨酸(>98.5%)、氯金酸(HAuCl4,99%):Aldrich公司;甲醇、檸檬酸、磷酸、濃硫酸(均為分析純):Aladdin公司。

      1.2 Au納米微粒的制備

      Au納米微粒的制備采用簡(jiǎn)單的Frens法[11-13],即在100 mL沸水中加入30 mg檸檬酸,在攪拌加熱下緩慢滴加入2 mL 0.5 mg/mL HAuCl4,反應(yīng)30 min后立即用冰水浴冷卻至室溫后4℃保存。

      1.3 修飾電極的制備

      電極的預(yù)處理:將金圓盤電極在金相砂紙上打磨,再依次用 0.3、0.1、0.05 μm Al2O3粉拋光,用水超聲清洗數(shù)分鐘后取出清洗;再置于0.5 mol/L稀H2SO4溶液中以10 V/s掃描速度在-0.5 V~2.0 V的電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描10 min,即為裸金電極(NAu)。

      修飾電極的自組裝過程:將預(yù)處理好的NAu電極置于0.01 mol/L L-半胱氨酸水溶液中進(jìn)行自組裝6 h后取出、用水超聲清洗5 min,為L(zhǎng)-半胱氨酸修飾電極(NAu/C);制備好的NAu/C電極再次放入Au納米微粒溶液中自組裝6 h后取出、用水清洗,為金納米微粒修飾電極(NAu/C/Au);將NAu/C/Au電極再次放入0.01 mol/L L-半胱氨酸水溶液中進(jìn)行自組裝6 h后取出用水清洗,為二次L-半胱氨酸修飾電極(NAu/C/Au/C)。制備的修飾電極浸泡在水中4℃保存。

      1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的制備

      準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,用適量甲醇及pH 6.8的磷酸緩沖溶液溶解定容至50 mL,得200.0 μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,再分別吸取若干用pH 6.8的磷酸緩沖溶液定容至 50mL,得到濃度分別為 6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0 μg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

      準(zhǔn)確稱取約0.10 g精制苦蕎茶用適量甲醇及pH 6.8的磷酸緩沖溶液超聲溶解,經(jīng)濾紙過濾定容于250 mL容量瓶中,待測(cè)。

      1.5 試驗(yàn)方法

      以修飾電極為工作電極,記錄-0.2 V~0.6 V范圍內(nèi)的差分脈沖伏安(Differential Pulse Voltammetry,DPV)信號(hào),其試驗(yàn)參數(shù)為:脈沖幅度50mV、脈沖寬度0.05 s、采樣寬度0.016 s、脈沖周期0.2 s、靜置時(shí)間為2 s。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 修飾電極的自組裝過程

      本試驗(yàn)所制備的Au納米微粒為酒紅色膠體溶液,其紫外可見吸收見圖2,吸收峰波長(zhǎng)約為530 nm,與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[11];經(jīng)高分辨TEM(圖2)表征發(fā)現(xiàn),Au納米微粒為球型微粒,納米微粒半徑為(8±2)nm,且能觀察到清晰的晶格線條紋,說明本試驗(yàn)所制備的Au納米微粒晶體生長(zhǎng)較完整。

      圖2 Au納米微粒的光學(xué)與形貌表征Fig.2 The optical characteristic and morphology of Au nanoparticles

      在電極的自組裝過程中,半胱氨酸分子首先通過巰基與裸Au電極表面的相互作用,定向自組裝在裸Au電極的表面;半胱氨酸分子的氨基再通過靜電作用力與表面帶負(fù)電荷的Au納米微粒相互作用,使Au納米微粒自組裝在半胱氨酸分子表面;最終半胱氨酸分子再通過巰基自組裝于Au納米微粒表面,形成一種典型的多層結(jié)構(gòu)修飾電極,其組裝示意圖見圖3。

      2.2 蘆丁在修飾電極上的電化學(xué)行為

      圖4為蘆丁分子在NAu/C修飾電極上的循環(huán)伏安曲線圖。

      在0.1 V~0.4 V之間出現(xiàn)一對(duì)明顯的氧化還原峰。蘆丁是一種重要的黃酮類物質(zhì),其抗氧化活性成分主要來源于蘆丁分子結(jié)構(gòu)上苯環(huán)羥基。在pH 6.8的磷酸緩沖溶液中,掃描循環(huán)伏安過程時(shí),蘆丁分子B環(huán)上的3’,4’-取代羥基發(fā)生兩電子兩質(zhì)子氧化還原反應(yīng),進(jìn)一步發(fā)生電子重排[9-10,13],此氧化還原反應(yīng)對(duì)應(yīng)于循環(huán)伏安曲線中的0.21 V還原電位峰和0.26 V氧化電位峰。

      然而,蘆丁分子在NAu/C修飾電極上的循環(huán)伏安氧化還原電位峰很弱,對(duì)蘆丁的信號(hào)響應(yīng)靈敏度很低。為了提高響應(yīng)靈敏度,繼續(xù)考察了蘆丁分子在修飾電極上的差分脈沖伏安(DPV)信號(hào)響應(yīng),結(jié)果見圖5。

      圖3 修飾電極的自組裝示意圖Fig.3 Schematic illustration of the modified electrode fabrication process

      圖4 蘆丁分子在NAu/C修飾電極上的循環(huán)伏安曲線圖Fig.4 Cyclic vohammograms of rutin on the NAu/C modified electrode

      圖5 蘆丁分子在NAu/C和NAu/C/Au/C修飾電極上的差分脈沖伏安圖Fig.5 DPV of the NAu/C and NAu/C/Au/C modified electrode

      在pH 6.8的磷酸緩沖溶液中,蘆丁分子在NAu/C修飾電極上通過差分脈沖伏安掃描出現(xiàn)了位于0.23 V處的氧化峰,并且隨著電極的進(jìn)一步修飾,在NAu/C/Au/C多層修飾電極上,0.23 V處的氧化峰信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)。這是由于具有大比表面積Au納米微粒對(duì)電極的多層修飾,增加了氧化還原反應(yīng)位點(diǎn),提高了修飾電極對(duì)蘆丁分子響應(yīng)靈敏度。

      2.3 差分脈沖伏安法對(duì)蘆丁的定量測(cè)定

      在pH 6.8的磷酸緩沖溶液中,對(duì)不同濃度的蘆丁采集了DPV電化學(xué)信號(hào)如圖6所示。

      圖6 蘆丁差分脈沖伏安測(cè)定信號(hào)的線性關(guān)系Fig.6 The linear relationship of DPV signals on rutin

      隨著蘆丁濃度的增加,DPV在0.23V處的信號(hào)峰也隨之增加,其峰電流與蘆丁的濃度呈線性變化關(guān)系,線性回歸方程為 I(μA)=0.112C(μg/mL)+0.07,相關(guān)系數(shù) R2=0.999 3,儀器檢出限(3S/N)為 0.024 μg/mL,結(jié)果見表1。

      表1 不同儀器方法測(cè)定蘆丁的靈敏度比較Table 1 Different methods of determination of rutin

      分析方法檢出限為6.0 mg/100 g。重復(fù)10次測(cè)定蘆丁,其RSD為1.70%,方法重復(fù)性滿足定量測(cè)定要求。

      2.4 實(shí)際樣品中蘆丁的測(cè)定

      用差分脈沖伏安法對(duì)精制苦蕎茶樣液中的蘆丁含量進(jìn)行了測(cè)定,并且用紫外可見分光光度法[14]和高效液相色譜法[3]對(duì)樣品做了方法比對(duì)試驗(yàn),測(cè)定結(jié)果如表2所示。

      表2 不同方法測(cè)定苦蕎茶樣品中蘆丁的結(jié)果比較Table 2 Measurement result of rutin in Buckwheat tea with different methods

      從表2中可以看出,本方法對(duì)實(shí)際樣品中的蘆丁含量測(cè)定的3次平行性結(jié)果為2.10 g/100 g(RSD值小于5.0%),與高效液相色譜法結(jié)果相比略高7.3%,而相比紫外分光光度法而言,結(jié)果低了近30%。結(jié)果表明,本法可以通過DPV測(cè)定電位的不同將其他具有類似酚羥基結(jié)構(gòu)分子的雜質(zhì)物質(zhì)對(duì)蘆丁組分的測(cè)定干擾進(jìn)行有效的降低,但是仍然有約7%的干擾,但此結(jié)果在可接受范圍之內(nèi)。

      同時(shí),試驗(yàn)了實(shí)際樣品的回收率,以1號(hào)樣品溶液20 mL 為母液(10.91 μg/mL),分別加入 0.2、0.5、0.7 mL 200.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,制得3組標(biāo)準(zhǔn)加入樣品,分別測(cè)定回收率,結(jié)果如表3所示。

      表3 苦蕎茶樣品中蘆丁加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Measurement result of Recovery experiments in Buckwheat tea

      回收率在99.65%~101.10%之間,表明此方法用于試劑樣品中蘆丁含量的測(cè)定具有較高的準(zhǔn)確性。

      3 結(jié)論

      本文以半胱氨酸與Au的靜電吸附自組裝原理,制備了一種多層結(jié)構(gòu)的半胱氨酸/納米金修飾電極。在此修飾電極上研究了蘆丁分子的電化學(xué)行為,利用蘆丁分子在修飾電極上的兩電子兩質(zhì)子氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的位于0.23 V處差分脈沖伏安信號(hào),建立了一種蘆丁定量分析方法。該方法線性回歸方程為I(μA)=0.112C(μg/mL)+0.07,相關(guān)系數(shù) R2=0.999 3,且具有較低的檢出限,重復(fù)10次測(cè)定蘆丁,其RSD為1.70%,方法重復(fù)性滿足定量測(cè)定要求,與高效液相方法和紫外分光光度法比較,該方法能夠簡(jiǎn)便、快速、高效地適應(yīng)于復(fù)雜體系中蘆丁含量的測(cè)定。

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