天麻多糖的提取及其飲料的研制

鄭捷，孫朋朋，胡愛軍，2，*，胡小華，任圓圓，于思雨

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心，天津300457；2.天津市寬達(dá)水產(chǎn)食品有限公司，天津300304）

天麻又名赤箭、定風(fēng)草、獨搖芝，為蘭科天麻屬植物。據(jù)神農(nóng)本草經(jīng)和本草綱目記載，天麻（Gastrodia elata Bl.）有非常好的藥理作用，是一種傳統(tǒng)名貴中藥。天麻對小兒驚厥[1]、記憶力減退[2]、坐骨神經(jīng)病[3]、頭暈?zāi)垦?、癲癇[4-5]等疾病有治療作用。它在錫蘭、新幾內(nèi)亞、澳大利亞、中國、朝鮮、日本和印度的多山地區(qū)均有種植[6]。在中國，野生天麻主要分布在四川、廣東、云南等省[7]。天麻含有多糖、有機酸、類固醇、酚類化合物等功能成分[8-10]。其特有的天麻素更是有著鎮(zhèn)靜安眠[11]、抗偏頭痛[12]、抗肝硬化[13]等功效。

天麻中含有豐富的天麻多糖，具有很好的藥理作用。繆化春等[1]發(fā)現(xiàn)天麻多糖能夠明顯降低高血壓模型大鼠的收縮壓和舒張壓。Hong Qiu等[14]從天麻中分離出 α-D-（1-4）葡聚糖和 α-（1-4）葡聚糖（WGEW、AGEW），發(fā)現(xiàn)這兩種葡聚糖衍生物對登革熱病毒有抑制作用。Xia Chen等[15]從天麻塊莖中分離出一種水溶性的葡聚糖（WTMA），它能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的繁殖。天麻多糖還有清除自由基、抗衰老的作用[16]。目前對天麻及其多糖的研究主要集中在藥理方面，而其食藥兼用、保健功能方面的研究仍具有重大潛在價值，值得進(jìn)一步開發(fā)。現(xiàn)在市場上的天麻產(chǎn)品主要是含有天麻素的一些制劑，天麻多糖類產(chǎn)品未見報道。本試驗采用單因素正交試驗優(yōu)化了天麻多糖的最佳提取條件，并采用天麻多糖提取液、紅棗汁、檸檬酸、白砂糖復(fù)配出一款抗氧化活性較好的天麻多糖飲料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天麻：陜西略陽縣中藥材技術(shù)推廣服務(wù)中心提供；紅棗、白砂糖：超市購買；檸檬酸：天津奧凱化工貿(mào)易有限公司；葡萄糖、重蒸酚、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TDZ5-W型離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；D66-101-1電子天平：天津市天宇試驗儀器有限公司；LGJ0.5型凍干機：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；752型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；HW·SY21-K電熱恒溫水浴鍋：北京市長風(fēng)儀器儀表公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

取天麻藥材，切片，干燥（80℃，1 h），粉碎，粉末過60目篩，備用。

1.3.2 天麻多糖提取方法

稱取適量的天麻粉末，加入一定比例的蒸餾水，在恒溫狀態(tài)下持續(xù)攪拌，一段時間后，離心（4 000 r/min，20 min），取上清液，得到天麻多糖提取液。

1.3.3 天麻多糖含量的測定方法

采取苯酚-硫酸法[17-18]測定天麻多糖的含量。以葡萄糖的質(zhì)量濃度（C，mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)回歸處理得線性回歸方程：Y=16.473X+0.004 7，R2=0.999 4。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

1.3.4 天麻多糖得率的測定

準(zhǔn)確稱取20 mg多糖粗品溶于水，定容于100 mL容量瓶中，用苯酚硫酸法測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品中的糖含量。天麻多糖得率計算公式如下：

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

式中：W為多糖得率，%；C為從曲線中查出的糖濃度，mg/mL；M1為多糖質(zhì)量；M2為原料質(zhì)量。

1.4 天麻多糖提取單因素試驗

1.4.1 料液比對天麻多糖得率的影響

稱取原料 5.00 g，料液比分別為 15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1（mL/g），60 ℃提取 1 h，苯酚－硫酸法測糖含量。

1.4.2 溫度對天麻多糖得率的影響

稱取原料 5.00 g，料液比 30 ∶1（mL/g），分別在 30、40、50、60、70 ℃，提取 1 h，苯酚－硫酸法測糖含量。

1.4.3 提取時間對天麻多糖得率的影響

稱取原料 5.00 g，料液比 30∶1（mL/g），分別在 60 ℃提取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，苯酚－硫酸法測糖含量。

1.5 L9（33）正交試驗

稱取天麻粉末5.00 g，在單因素的基礎(chǔ)上，以溫度、液料比和提取時間進(jìn)行正交試驗，正交試驗設(shè)計方案見表1。

表1 正交試驗L9（33）的因素與水平Table 1Factors and levels of L9（33）orthogonal text

1.6 天麻多糖飲料的制備

1.6.1 原料處理

1）根據(jù)天麻多糖提取最優(yōu)工藝條件，稱取天麻粉末，加入35倍量凈化水，在60℃提取2 h，提取液離心過濾備用。2）選擇核小肉厚、物霉?fàn)€、無蟲蛀的紅棗，去核，用6倍量的凈化水在85℃提取2次，每次提取2 h，合并提取液，過濾備用。

1.6.2 天麻提取液及棗汁不同配比預(yù)選

隨機挑選20個經(jīng)培訓(xùn)的食品相關(guān)專業(yè)的學(xué)生和老師，以口感和風(fēng)味為主要指標(biāo)，按照表2對天麻提取液及棗汁不同配比進(jìn)行感官評價，選擇口感、風(fēng)味較好的配比。

表2 天麻提取液和大棗提取液不同配比Table 2 Different extract ration of gastrodia elata and jujube

1.6.3 糖酸比單因素試驗

白砂糖和檸檬酸的比例分別為100∶1、120∶1、140∶1、160 ∶1、180 ∶1（體積比），以甜度程度為感官評價指標(biāo)，選取最優(yōu)的天麻提取液及大棗提取液配比。

1.6.4 天麻飲品配方優(yōu)化

對不同配比的天麻提取液與棗汁、白砂糖、檸檬酸進(jìn)行L9（34）正交試驗，通過模糊評定法給出各配方的綜合評分，評分標(biāo)準(zhǔn)：評定論域{氣味，香氣，酸度，甜度，苦澀}，權(quán)重系數(shù) {0.15，0.20，0.20，0.25，0.2}，評語論域 {<60，60~70，70~80，80~90，90~100}。正交設(shè)計表見表3。

表3 飲料配方優(yōu)化正交試驗表Table 3 Levels and factors of orthogonal test

1.7 天麻飲料抗氧化活性的測定

1.7.1 還原能力的測定

參考周海華等的方法[19]，取天麻飲品 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL加入試管中，不足1.0 mL用蒸餾水補足至1.0 mL，各管再加入0.2 mol/L，pH6.6的磷酸緩沖液2.5 mL 和質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）溶液2.5 mL，混合后在50℃保溫20 min后冷卻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液2.5mL，混合后以3000r/min的速度離心10 min，取上層液體2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%氯化鐵2.5 mL，混勻，靜置10 min，在700 nm處測定吸光度。吸光度越高，抗氧化性越好，還原力越強。以蒸餾水代替三氯化鐵溶液作為空白調(diào)零。

1.7.2 羥基自由基清除能力的測定

參考王宗君等的方法[20]，在各試管中分別加入不同濃度的天麻飲品1.0 mL、8.8 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L H2O2溶液 1.0 mL，9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液各1.0 mL，最后加入H2O2啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5 h，在510 nm下測量各溶液的吸光度?？紤]到天麻飲品本身的吸光度，以8.8 mmo1/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0 mL、不同濃度的天麻飲品1.0 mL和蒸餾水1.0 mL為天麻飲品的本底吸收。清除率計算公式：

式中：A0為空白對照液的吸光度；Ai為加入天麻飲品后的吸光度；Aj為不加H2O2天麻飲品本底的吸光度。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。P＜0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著差異，所有試驗均重復(fù)3次。所有圖中出現(xiàn)的字母代表不同水平之間的顯著性，相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯著，大寫字母表示置信度0.01水平所測得，小寫字母表示置信度0.05水平下所測得。

2 結(jié)果與分析

2.1 液料比對天麻多糖得率的影響

在提取溫度為60℃，提取時間為1 h條件下，不同液料比 15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1（mL/g）對多糖得率的影響如圖2所示。

圖2 料液比對天麻多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on polysaccharide yield

由圖 2 可知，液料比在 15∶1（mL/g）～25∶1（mL/g）范圍內(nèi)，天麻多糖得率從8.92%快速增加到11.93%，液料比在 25∶1（mL/g）～35∶1（mL/g）范圍內(nèi)時，增加的趨勢明顯變緩，天麻多糖得率在液料比30∶1（mL/g）時（11.93%）與 35∶1（mL/g）（11.96%）相比，差異不顯著，這可能是因為隨著料液濃度升高，天麻組織內(nèi)外濃度差也相應(yīng)升高，天麻多糖不易溶出的原因[21]，也可能是因為液料比在25∶1（mL/g）時，天麻多糖的溶出量大于其它雜質(zhì)的溶出量，隨著料液濃度的升高，其它雜質(zhì)溶出量大于天麻多糖[22]。

2.2 提取溫度對天麻多糖得率的影響

在天麻液料比 30∶1（mL/g），提取時間 60 min的條件下，研究不同提取溫度 30、40、50、60、70 ℃對天麻多糖得率的影響，如圖3所示。

圖3 提取溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of different temperature on polysaccharide yield

由圖3可知，30℃～50℃，隨著溫度的升高，天麻多糖得率增加顯著，溫度達(dá)到60℃時，天麻多糖得率達(dá)到最大值（12.21%），60℃～70℃，天麻多糖得率下降，這可能是因為適當(dāng)?shù)臏囟扔欣诒┞读u基的大分子物質(zhì)空間構(gòu)象的解析疊，進(jìn)而促進(jìn)氫鍵的形成或連接，多糖的親水性增加[23]；但是過高的溫度會引起多糖的降解反應(yīng)[24]。

2.3 提取時間天麻多糖得率的影響

天麻液料比 30∶1（mL/g），提取溫度 60℃，研究提取不同時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）對天麻多糖得率的影響，如圖4所示。

由圖4可知，隨著提取時間的延長，天麻多糖得率在不斷增加，在0.5 h～1.5 h之間，隨著時間的延長，天麻得率顯著增加，當(dāng)時間達(dá)到1.5 h后，天麻多糖得率趨于穩(wěn)定，這是可能因為在1.5 h時，提取液與細(xì)胞內(nèi)多糖濃度基本平衡，超過1.5 h，原料中有雜質(zhì)溶出，部分多糖發(fā)生降解[25]。

2.4 天麻多糖提取正交試驗結(jié)果

在單因素基礎(chǔ)上做正交試驗，結(jié)果如表4所示，正交試驗方差分析結(jié)果見表5。

圖4 提取時間天麻多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on polysaccharide yield

表4 正交試驗結(jié)果Table 4 Results of orthogonal array design test

表5 正交試驗方差分析結(jié)果Table 5 Results of analysis of variance

分析可知，各因素對多糖得率的影響順序為：A＞C＞B；即提取溫度＞提取時間＞料液比。根據(jù)方差分析結(jié)果，提取溫度為顯著性影響因素。正交試驗得到的最佳提取條件為：A3B3C1即提取溫度50℃，液料比35 ∶1（mL/g），提取時間 2 h。驗證試驗：天麻多糖得率為13.46%。

2.5 天麻飲料的制備

2.5.1 天麻提取液與棗汁不同配比的單因素試驗

以天麻提取液為主體部分，口感和風(fēng)味為主要指標(biāo)，對天麻提取液及棗汁不同配比進(jìn)行感官評價，評價結(jié)果見表6。

表6 天麻提取液和紅棗提取液不同配比的評價結(jié)果Table 6 The evaluation results of different extract ration of gastrodia elata and red dates

由表6可知，當(dāng)天麻提取液70%，大棗提取液30%時，苦澀味較淡，同時能保留天麻和大棗的風(fēng)味，初步選定天麻提取液和大棗提取液的配比為7∶3（體積比）。

2.5.2 不同糖酸比的單因素試驗

確定天麻提取液和大棗提取液的配比后，添加不同的糖酸比，進(jìn)行感官評價，結(jié)果見表7。

表7 糖酸比預(yù)選Table 7 Selection of sugar-acid proportions

2.5.3 天麻飲料配方優(yōu)化

選取白砂糖、檸檬酸、天麻提取液和大棗提取液的配比做L9（34）正交試驗，并運用模糊綜合評價法進(jìn)行品質(zhì)測評。測評結(jié)果見表8，方差分析結(jié)果見表9。

表8 感官評價結(jié)果Tablet 8 The sensory evaluation result

續(xù)表8 感官評價結(jié)果Continue tablet 8 The sensory evaluation result

表9 正交試驗方差分析表Table 9 Variance analysis of orthogonal tests

由表8和表9可知，影響天麻飲料配方的各因素的主次順序為：B＞A＞C，即白砂糖＞天麻多糖與紅棗提取液＞檸檬酸，而且白砂糖、天麻多糖和大棗提取液的用量對感官評分的影響都達(dá)到了極顯著水平，分析得出最佳水平組合為A2B1C2，即天麻提取物：棗汁為7∶3（體積比）、白砂糖6%、檸檬酸0.05%，此結(jié)果與感官評分得分最高的組合A2B1C2相符。

2.5.4 天麻飲料抗氧化能力的測定

在一般情況下，樣品的還原力與抗氧化活性之間有顯著的相關(guān)性，吸光度越大表示還原力越強見圖5。

圖5 天麻飲料的還原能力Fig.5 Reduction capacity of gastrodia elata drinks

由圖5可知，天麻飲品具有一定的還原能力，還原力隨著天麻飲品量的增大而增加。

2.5.5 天麻飲料羥基自由基清除能力測定

羥自由基的化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，其毒性也是最大的，可與多種有機物或無機物反應(yīng)。對天麻飲料進(jìn)行不同程度的濃縮或稀釋，測定其清除羥基自由基的能力，結(jié)果見圖6。

圖6 天麻飲料對·OH的清除作用Fig.6 Scavenging effects of gastrodia elata drinks on·OH

由圖6可知，天麻飲料對·OH有很好的清除能力，并在一定的范圍內(nèi)顯現(xiàn)出劑量效應(yīng)，天麻飲料原液對羥基自由基的清除率達(dá)到了80.65%，濃縮為原液的2倍后天麻飲品的抗氧化性達(dá)到96.30%，繼續(xù)濃縮，天麻飲品濃度繼續(xù)升高，清除能力趨于平衡，不再升高。

2.6 天麻飲品的質(zhì)量評價

2.6.1 感觀指標(biāo)

色澤：淺紅色；

滋味及氣味：天麻、紅棗味協(xié)調(diào)一致，酸甜適中，無異味；

組織形態(tài)：汁液均勻一致，無雜質(zhì)。

2.6.2 理化指標(biāo)

可溶性固形物（糖度）為9°Bx左右，酸度為pH值4.6左右。

2.6.3 衛(wèi)生指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)≤100個/mL，大腸菌群數(shù)≤6個/mL，致病菌未檢出。

3 結(jié)論

天麻多糖的最佳提取條件為：提取溫度80℃，液料比30∶1（mL/g），提取時間 2 h，此時天麻多糖得率為13.46%。此外，通過單因素和正交試驗確定了天麻飲料的最佳配方為天麻提取液∶紅棗汁7∶3體積比、白砂糖6%、檸檬酸0.05%，該飲料具有較好的抗氧化活性。

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