響應(yīng)面優(yōu)化臍橙皮中果膠的提取工藝及理化性質(zhì)分析

沈銳，謝青松，趙壯志，稅春玲，李磊

（1.重慶市永川食品藥品檢驗(yàn)所，重慶402160；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院，重慶402160）

天然果膠類物質(zhì)主要以原果膠、果膠、果膠酸3種狀態(tài)廣泛存在于植物的果實(shí)、根、莖、葉中，它們伴隨纖維素而存在，構(gòu)成細(xì)胞中間層粘結(jié)物，使植物組織細(xì)胞緊緊黏結(jié)在一起[1]。原果膠不溶于水，但可在酸、堿、鹽、酶的作用下，可加水分解轉(zhuǎn)變成水溶性果膠[2]。不同的果蔬含果膠物質(zhì)的量不同，果膠在穩(wěn)定性、增稠、乳化和膠凝方面性質(zhì)良好[3]。中國西南重慶地區(qū)盛產(chǎn)臍橙，每年大量的臍橙皮廢棄，少部分轉(zhuǎn)化為低效用的農(nóng)業(yè)肥料，總體來說造成大量的浪費(fèi)。從臍橙皮中提取的果膠是高酯化度的果膠，在食品工業(yè)中作為添加劑常用來制作果醬、果凍等食品。

而在國內(nèi)果膠作為用途廣泛的添加劑需求量正在以每年5%～10%的速度快速增長。全世界果膠的年需求量約4萬噸，其中美國6 500 t，俄羅斯2 700 t，日本2 300 t。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)我國每年約消耗5 000 t，其中從外國進(jìn)口約占80%，同世界平均水平相比仍呈高速增長趨勢[4-5]。果膠主要生產(chǎn)國有丹麥、英國、美國、以色列、法國等，亞洲國家產(chǎn)量極少，特別是消費(fèi)量約占世界產(chǎn)量10%的日本因無生產(chǎn)廠家，完全依靠進(jìn)口[6]。在我國巨大的果膠缺口，使國產(chǎn)果膠成了國內(nèi)眾多企業(yè)的期盼，因此大力開發(fā)果膠生產(chǎn)新工藝，利用我國豐富的果膠資源，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)果膠，滿足國內(nèi)外市場需求已顯得極為迫切。目前果膠質(zhì)量差、產(chǎn)量低卻是我國果膠產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀，要改變果膠依賴進(jìn)口就需要更加先進(jìn)的生產(chǎn)工藝。本文是就在臍橙皮中提取果膠工藝的探討。雖然目前有關(guān)臍橙果膠提取工藝優(yōu)化的文章已有不少，但關(guān)于細(xì)化到響應(yīng)面研究還比較少，當(dāng)然目前關(guān)于兩種優(yōu)化方法的選擇存在分歧，對比研究正交設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法試驗(yàn)對臍橙皮中果膠提取，發(fā)現(xiàn)兩種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法各有優(yōu)點(diǎn)，正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)次數(shù)相對較少，且方法簡便，響應(yīng)面法對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析優(yōu)于正交試驗(yàn)。由此可見兩種方法各有優(yōu)勢，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)不能一概而論，為了避免在試驗(yàn)中選擇優(yōu)化方法的隨意性和盲目性，尋找出最優(yōu)的提取條件，本文將正交設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法分別用于臍橙皮中果膠提取工藝的優(yōu)化，探討兩種方法對臍橙皮中果膠提取工藝優(yōu)化的差別，以便為試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)提供合理的指導(dǎo)，本文給出了正交和響應(yīng)面的分析比較，為其他工藝研究給出了參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

臍橙：重慶奉節(jié)臍橙；無水乙醇、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉等均為分析純：成都科龍?jiān)噭?/p>

GRX-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SHZ-B恒溫水浴鍋：上海龍躍儀器設(shè)備公司；TE216-L精密天平：賽多利斯；PHS-3C酸度計(jì)：上海佑科；MDJ-A01Y1食品粉碎機(jī)：上海小熊；TG16-WS離心機(jī)：湖南湘儀；LT-15-11-330馬弗爐：德國納博熱；T50自動(dòng)電位滴定儀：瑞士梅特勒-托利多；FE20酸度計(jì)：梅特勒（上海）公司；ICE3000原子吸收分光光度計(jì)：美國賽默飛世爾；K-350水蒸氣蒸餾儀：瑞士步琦。

1.2 方法

1.2.1 果膠提取流程

取臍橙外皮，煮沸滅酶，再用去離子水漂洗3次至漂洗液無色，然后置于55℃烘箱中烘干，將烘干后的產(chǎn)品置食品粉碎機(jī)中粉碎過60目篩，得到果皮備用。調(diào)節(jié)pH值，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值在0.4～2.0范圍。恒溫浸提，浸提時(shí)間控制在40 min～120 min，溫度控制在65℃～85℃。用離心機(jī)進(jìn)行固液分離，速度在3 000 r/min，時(shí)間15 min，收集上清液。待轉(zhuǎn)移出上清液后，在不斷攪拌下加入1.5倍體積的無水乙醇。將果膠醇沉溶液置于25℃室溫中靜置1 h，離心分離，收集離心沉淀。無水乙醇2～3洗滌，于55℃條件下干燥至恒重。

1.2.2 果膠提取率計(jì)算

臍橙皮果膠提取率的測定采用重量法，果膠提取計(jì)算公式

式中：p為果膠提取率，%；m為提取得到的果膠得質(zhì)量，g；W為樣品臍橙皮的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 液料比對果膠得率的影響

準(zhǔn)備備用的果皮粉5.0 g，分別以液料比10∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）的量，加鹽酸使提取液pH值為0.8，離心醇沉提取，浸提溫度75℃，提取時(shí)間80 min，乙醇濃度60%，沉淀時(shí)間60 min。然后經(jīng)過離心、洗滌、干燥計(jì)算果膠得率，確定適宜液料比。

1.2.3.2 pH值對果膠得率的影響

準(zhǔn)備備用的果皮粉5.0 g，加去離子水使液料比為20∶1（mL/g），加鹽酸調(diào)節(jié)提取液pH值分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0，離心醇沉提取，浸提溫度 75 ℃，提取時(shí)間80 min，乙醇終濃度60%，沉淀時(shí)間60 min。然后經(jīng)過離心、洗滌、烘干至質(zhì)量恒定，計(jì)算果膠得率，確定適宜pH值。

1.2.3.3 浸提溫度對果膠得率的影響

準(zhǔn)備備用的果皮粉5.0 g，加去離子水使液料比為20 ∶1（mL/g），加鹽酸調(diào)節(jié)提取液 pH 值為 0.8，離心醇沉提取，浸提溫度分別為 65、70、75、80、85 ℃，提取時(shí)間80 min，乙醇終濃度60%，沉淀時(shí)間60 min。然后經(jīng)過離心、洗滌、烘干至質(zhì)量恒定，計(jì)算果膠得率，確定適宜浸提溫度。

1.2.3.4 提取時(shí)間對果膠提取率的影響

準(zhǔn)備備用的果皮粉5.0 g，加去離子水使液料比為20 ∶1（mL/g），加鹽酸調(diào)節(jié)提取液 pH 值為 0.8，離心醇沉提取，浸提溫度為75℃，提取時(shí)間分別為40、60、80、100、120 min，乙醇終濃度 60%，沉淀時(shí)間 60 min。然后經(jīng)過離心、洗滌、烘干至質(zhì)量恒定，計(jì)算果膠得率，確定適宜提取時(shí)間。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)分析基礎(chǔ)上，以果膠得率作為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，優(yōu)化果膠提取工藝，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)分析基礎(chǔ)上，以果膠得率作為評價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化果膠提取工藝，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面分析因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對臍橙果皮果膠提取率的影響

液料比對果膠提取率的影響見圖1。

圖1 液料比對果膠提取率的影響Fig.1 Effects of the solid-liquid ratio on extraction yield of pectin

由圖1可知，隨著液料比的增大，果膠提取率在增加，當(dāng)液料比20∶1（mL/g）以后，果膠率達(dá)到頂點(diǎn)，之后緩緩下降。這可能是當(dāng)液料比太小的時(shí)候，不能完全溶解物料和提取物，而當(dāng)體積太大，在后續(xù)的濃縮工藝帶損耗，因此，液料比選擇20∶1（mL/g）為宜。

2.1.2 pH值對果膠提取率的影響

pH值對果膠提取率的影響見圖2。

圖2 pH值對果膠提取率的影響Fig.2 Effects of pH on extraction yield of pectin

由圖2可知，隨著pH值過低時(shí)，溶液極性較強(qiáng)，對果膠分子甙鍵和酯鍵斷裂，果膠發(fā)生解聚。隨pH值上升，酸性條件下，果膠轉(zhuǎn)化為水溶性果膠，果膠提取率在上升，但是pH值進(jìn)一步上升，果膠轉(zhuǎn)化為果膠酸，穩(wěn)定性下降，得率降低。綜合以上，選擇pH值為0.8。

2.1.3 浸提溫度對果膠提取率的影響

浸提溫度對果膠提取率的影響見圖3。

圖3 浸提溫度對果膠提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on extraction yield of pectin

由圖3可知，隨著浸提熱處理中，果膠會(huì)發(fā)生脫甲基和β消除兩種非酶反應(yīng)，原果膠水解成可溶果膠，但是隨著溫度的升高，β消除反應(yīng)速率不斷升高，果膠降解，果膠得率下降。綜合以上，選擇浸提溫度為80℃[7－8]。

2.1.4 提取時(shí)間對果膠提取率的影響

提取時(shí)間對果膠提取率的影響見圖4。

圖4 提取時(shí)間對果膠提取率的影響Fig.4 Effects of extraction time on extraction yield of pectin

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增大，果膠質(zhì)得到充分的水解，溶解為水溶性果膠，但是隨著時(shí)間過長，在酸性條件下，果膠發(fā)生降解，提取率也隨之降低。綜合以上，選擇提取時(shí)間為100 min[9]。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

為確定果膠提取最佳工藝參數(shù)，在單因素的試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取四因素三水平L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表，正交試驗(yàn)方案和結(jié)果見表2，以果膠的得率作為評價(jià)指標(biāo)，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定臍橙果膠最佳工藝條件。分別用正交試驗(yàn)最佳工藝條件進(jìn)行6組試驗(yàn)，果膠的提取率平均提取率為22.31%[10－11]。

由極差R分析可知，各因素影響主次順序?yàn)锳＞B＞D＞C最佳工藝組合為A1B2C2D2，即臍橙皮果膠提取工藝的最佳條件為為：液料比 20 ∶1（mL/g）、pH0.8、提取時(shí)間100 min、溫度80℃。從正交結(jié)果可知，液料比對結(jié)果影響較大。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental design and result of orthogonal method

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表4，用Design－Expert 8.0.6對表中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到回歸模型方程（2），方差分析見表5[12]。

表4 響應(yīng)面法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Experiment design and results of response surface method analysis

續(xù)表4 響應(yīng)面法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 4 Experiment design and results of response surface method analysis

表5 回歸模型方差分析表Table 5 Variance analysis of regression model

回歸模型方程：果膠提取率/%=22.25－3.90A+1.73B+0.15C+1.04D+3.83AB－0.083AC－0.85AD－4.74BC－1.44BD－1.96CD－3.26A2－4.66B2－3.38C2－5.10D2（2）

由表中可知，失擬項(xiàng) F=5.54，P=0.056 7＞0.05，差異不顯著，模型擬合較好；模型 F=106.36，P＜0.000 1，達(dá)到極顯著，回歸方差模型高度顯著的，說明試驗(yàn)誤差小，可以用此模型對果膠工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。影響方程的因素中C和AC差異不顯著，AD差異顯著，其余各因素及各因素交互作用的P值均小于0.01，差異均為極顯著[13]。根據(jù)各因素F值的大小可知，各因素主效應(yīng)關(guān)系為：A（液料比）＞B（pH 值）＞D（提取溫度）＞C（提取時(shí)間），與上面的單因素分析和正交分析結(jié)論吻合。

2.3.2 交互作用分析

各因素交互作用對果膠提取率影響的響應(yīng)曲面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對果膠提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Three-dimension response surface plot of the combined effects of each factor on the extraction rate of pectin

響應(yīng)面等高線圖直接展示了每個(gè)因素對預(yù)測值的影響，以及各因變量之間的相互作用。橢圓說明兩個(gè)因變量之間有顯著的相互影響，而圓形則正好相反。圖5直觀的反應(yīng)了4個(gè)因素之間的交互關(guān)系，從響應(yīng)面的最高點(diǎn)可以看出，在所選范圍存在極值。從響應(yīng)面曲面坡度的大小和等高線可以看出因素間交互作用的強(qiáng)弱和因素對響應(yīng)值的影響程度。將其中任意兩個(gè)因素固定在零水平，另外兩個(gè)因素對響應(yīng)值的影響。以圖5（a）可例，固定提取時(shí)間和提取溫度，當(dāng)液料比處于低水平的時(shí)候，果膠提取率隨溶液pH值的增大先增大后下降，當(dāng)液料比處于高水平的時(shí)候，果膠提取率隨溶液pH值的增大先緩緩增大后緩緩下降，當(dāng)處于溶液pH值低水平的時(shí)候，果膠提取率隨液料比的增大而下降，當(dāng)溶液pH處于高水平的時(shí)候，果膠提取率隨液料比的增大先增大后下降。由此類推可知圖 5 中（a）（c）（d）（e）（f）兩因素影響作用，等高線為橢圓知 AB、AD、BC、BD、CD 兩兩交互作用顯著，而（b）圖等高線接近于圓形，說明AD交互作用不顯著，與方差分析具有一致性[12]。

2.3.3 最佳工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)所得到的模型，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對模型進(jìn)行分析，預(yù)測出酸提取法最佳工藝條件為：液料比21.27∶1（mL/g），溶液pH0.714，提取時(shí)間102.68 min，提取溫度80.84℃，考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件調(diào)整為：液料比 21∶1（mL/g），溶液pH0.7，提取時(shí)間102 min，提取溫度81℃。在最佳工藝條件下進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，果膠提取率平均值為23.52%，與理論預(yù)測值基本吻合。說明了回歸方程的預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值之間具有較好的擬合度，相比較之下，響應(yīng)面分析比正交分析和單因素分析有明顯優(yōu)勢，不容易忽略最優(yōu)參數(shù)。

3 正交試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化效果比較

通過兩種方法用于優(yōu)化臍橙皮中果膠提取的結(jié)果可以看出，正交試驗(yàn)法是從全面試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行極差分析，以獲得最優(yōu)的因素組合，它是一種快速經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，具有簡單易行的特點(diǎn)，但是不可能像全面試驗(yàn)一樣對各因素效應(yīng)、交互作用進(jìn)行一一分析，當(dāng)有交互作用存在時(shí)，可能出現(xiàn)交互作用混雜，因此它不能在整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式（即回歸方程），也就無法找到整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。而響應(yīng)面法則是給出兩個(gè)極值，通過爬坡試驗(yàn)等獲得其范圍內(nèi)最優(yōu)的條件組合，并且能夠反映各因素之間的交互作用，與正交試驗(yàn)法相比更加精確和直觀。響應(yīng)面法雖然試驗(yàn)次數(shù)較多，但能夠在整個(gè)區(qū)域上進(jìn)行連續(xù)的分析，找出最合適的條件，試驗(yàn)精度較高[14]。

4 臍橙皮果膠理化性質(zhì)

根據(jù)國家強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)GB 25533-2010《食品添加劑果膠》中涉及的方法對提取的樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見表6，可以看到該品各項(xiàng)指標(biāo)高于果膠標(biāo)準(zhǔn)，特別是總半乳糖醛酸含量為69.8%，證明果膠純度較好[10，15-16]。

表6 果膠制品質(zhì)量特征Table 6 Quality characteristics of pectin products

5 其他樣品果膠提取率

其他樣品果膠提取率見圖6。

圖6 其他樣品果膠提取率Fig.6 Extraction rate of pectin in other samples

如圖6所示，現(xiàn)階段我國生產(chǎn)果膠原料中產(chǎn)量較高的是橙皮、火龍果皮、檸檬皮及其果渣，但是橙皮的優(yōu)勢是產(chǎn)量比火龍果和檸檬大很多，價(jià)格低廉，原料來源簡單容易，是發(fā)展果膠提取工業(yè)很有優(yōu)勢的原料。

6 結(jié)論

以臍橙皮為果膠提取原料，采用以酸提取為基礎(chǔ)結(jié)合加熱提取，最后乙醇沉淀的方法提取果膠，通過單因素、正交、響應(yīng)面綜合分析，得到臍橙果膠得最佳工藝條件為，液料比 21 ∶1（mL/g），溶液 pH0.7，提取時(shí)間102 min，提取溫度81℃，乙醇最終濃度60%，沉淀時(shí)間60 min，其提取率為23.52%。與相對于其他提取方法來說，該提取方法簡單，能耗小，設(shè)備簡單，適合鄉(xiāng)鎮(zhèn)在發(fā)展臍橙皮廢料制果膠產(chǎn)業(yè)中使用，為臍橙皮的廢物利用提供了很好的參考[16-17]。

[1] 王勝利,朱曉敏,劉佳影,等.辣椒粕果膠提取工藝的優(yōu)化[J].中國食品添加劑,2016(8):79-85

[2] 趙豐麗,呂金蓮,吳奔,等.紫薯渣果膠提取工藝研究[J].中國釀造,2016,35(11):133-135

[3] 李加興,吳萍,吳越,等.八月瓜果皮果膠提取工藝優(yōu)化及其理化特性研究[J].食品工業(yè)科技,2016,37(1):

[4] 趙學(xué)思,劉亞瓊,董洋,等.酸水解法提取雪花梨皮果膠工藝研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,39(3):37-41

[5] 洪晶陽,李煥榮,許建,等.響應(yīng)面法優(yōu)化核桃青皮果膠提取工藝的研究[J].食品科技,2017(1):68-71

[6] 臺建祥,范鴻雁,薛慧,等.菠蘿蜜果皮果膠提取工藝的優(yōu)化[J].食品科技,2014(1):236-239

[7] Roeck A D,Duvetter T,Fraeye I,et al.Effect of high-pressure/high-temperature processing on chemical pectin conversions in relation to fruit and vegetable texture[J].Food Chemistry,2009,115(11):207-213

[8] Round A N,Rigby N M,MacDougall A J,et al.A new view of pectin structure revealed by acid hydrolysis and atomic force microscopy[J].Carbohyd Res,2010,345:487-497

[9] Petkowicz C L D,Vriesmann L C,Teofilo R F.Optimization of nitric acid-mediated extraction of pectin from cacao pod husks(Theobroma cacao L.)using response surface methodology[J].C arbohyd Polym,2011,84(4):1230-1236

[10]孟鴛,盧小菊,夏小慧.響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取柚皮果膠工藝的研究[J].中國食品添加劑,2017(2):57-64

[11]曹東,黎星辰,唐靜,等.檸檬果渣果膠提取工藝研究[J].中國釀造,2015,34(4):128-131

[12]張攀,熊雙麗,薛朝云.豆腐柴葉果膠的提取與理化性質(zhì)分析[J].食品工業(yè)科技,2016,37(16)

[13]苗壯,樊明濤,程拯艮,等.響應(yīng)面優(yōu)化亞臨界水提取獼猴桃皮渣中果膠及其品質(zhì)分析[J].食品工業(yè)科技,2016,37(12)

[14]黃菊,瞿淑敏.正交設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥中蘆丁提取工藝的比較[J].糧食和油脂,2014,27(9):45-48

[15]中華人民共和國發(fā)展和改革委員會(huì).QB 2484-2000,中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2000

[16]中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB 25533-2010,食品添加劑果膠[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010

[17]Kravtchenko T P,Arnould I,Voragen A G J,et al.Improvement of the selective depolymerization of pectic substances by chemical βelimination in aqueous solution[J].Carbohydrate Polymers,1992,19:237-242