94個茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析

楊 軍，王讓劍，孔祥瑞，鄭國華，邱陳華

(福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心福建分中心/農(nóng)業(yè)部福建茶樹及烏龍茶加工科學觀測實驗站，福建 福安 355015)

茶樹是山茶科山茶屬茶組的多年生常綠木本植物[1]，且為常異花授粉植物，具有高度雜合性，其遺傳基礎(chǔ)較為復雜，種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀與加工品質(zhì)鑒定難度大、時間長，對茶樹種質(zhì)資源保護與新品種選育工作造成較大的困難。近些年，EST-SSR來自于功能基因，具有多態(tài)性高、共顯性、技術(shù)簡單、重復性好等特點[2-5]，在茶樹遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、群體結(jié)構(gòu)分析、種質(zhì)資源鑒定篩選與輔助育種中廣泛應用[6-9]。對茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析是野生茶樹種質(zhì)初步鑒定的重要手段。黃曉霞等[10]的研究結(jié)果說明千家寨不同海拔梯度上野生茶樹居群遺傳多樣性隨著海拔梯度的遞增，居群的遺傳多樣性呈現(xiàn)出低-高-低的分布；毛娟等[11]發(fā)現(xiàn)樣本量在40個時，能較好地反映云南白鶯山地區(qū)茶樹資源的遺傳多樣性；張明澤等[12]認為黔南野生茶樹資源間的遺傳差異較大，遺傳基礎(chǔ)較寬，具有豐富的遺傳多樣性。郭燕等[13]研究表明40個貴州古茶樹資源有較高的遺傳多樣性，主要是由遺傳因素和地理位置不同引起。周萌等[14]認為樹齡3200年的香竹簧茶樹王與野生茶樹、栽培型茶樹品種之問的遺傳關(guān)系較遠。姜曉輝等[15]研究表明廣東歷史名茶茶樹群體羅坑與馬圖群體間在過去的某個時間可能有過基因交流。茶樹種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)分析也有較多研究。王麗鴛等[16]認為龍井群體的遺傳分化程度較低。姚明哲等[17]認為江北茶區(qū)主要省份間茶樹種質(zhì)的遺傳分化程度低。喬婷婷等[18]認為茶樹地方品種、選育品種(系)具有相對獨立的群體結(jié)構(gòu)，選育品種(系)根據(jù)親緣關(guān)系的不同形成不同的類群。吳曉梅等[19]認為烏龍茶品種與綠茶品種間的遺傳結(jié)構(gòu)存在差異。本試驗對福建省主要審(鑒)定品種、茶樹自然雜交后代群體、地方搜集資源群體進行個體材料的親緣關(guān)系、遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)分析，以期為茶樹種質(zhì)初步鑒定與分子標記輔助育種提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試材料來源于福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，福建省茶樹種質(zhì)資源及其自然雜交后代共94個(詳見表1)，采集各個材料一芽二葉鮮葉后用液氮迅速冷凍處理，保存在-70℃冰箱中備用。

表1 94份供試材料的名稱與來源

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用改進的CTAB法[20]提取茶樹基因組DNA。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行茶樹基因組分子量大小檢測，用756-MC型紫外分光光度計測定茶樹基因組DNA的純度(OD260/280比值)。

1.2.2 引物合成 參照文獻[21]引物序列，序列由上海Sangon公司合成，引物信息見表2。

1.2.3 PCR擴增和產(chǎn)物鑒定 PCR反應體系為：ddH2O 18.8 μL，10×Buffer 2.5 μL(Mg2+)，dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL，上、下游primer(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq polymerase 0.2 μL(0.5U)，模板DNA 1μL。PCR反應于美國ABI-9600型擴增儀上進行，熱循環(huán)程序為：94℃預變性4 min，使模板DNA 充分變性，然后進入下列溫度循環(huán)：94℃變性45 s，不同溫度條件退火60 s，72℃延伸75 s，重復35個熱循環(huán)；72℃延伸10 min，最后4℃保存。

引物統(tǒng)一在反向引物(R)的5′段標記熒光(FAM/TAMRA)，由上海百力格生物科技有限公司合成。擴增產(chǎn)物0.5 μL，GeneScanTM500 ROXTM0.5 μL，HiDi 9 μL，混勻后使用ABI公司3730XL進行毛細管電泳。

1.2.4 群體結(jié)構(gòu)分析 使用Struture 2.3.4[22]進行群體結(jié)構(gòu)分析，先計算各材料歸屬第k亞群的概率Q值。使用混合模型K值從3設(shè)置到10模擬群體結(jié)構(gòu)，每一個K值重復5次。將MCMC迭代設(shè)為100000次，初始burn-in次數(shù)為100000。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用ABI公司的GeneMapper4.0軟件，選擇GeneScanTM500 ROXTM作為分子量標準，對每一個擴增出的條帶記錄大小。運用PopGen3.2軟件計算Shannon信息指數(shù)(I)和Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)。運用NTSYSpc2.1中的Tree plot程序進行聚類分析。

表2 17對 SSR 引物及其序列

2 結(jié)果與分析

2.1 94個材料間親緣關(guān)系分析

從圖1上看出，白雞冠與其自然雜交后代4個聚類在一起，說明白雞冠自然雜交后代遺傳組成主要來自于母本白雞冠，后代遺傳相對穩(wěn)定(i)；福云6號與其自然雜交后代分為2個類群，其中，第一類群B1、B2、B3與福云6號(B11)聚類在一起(ii)，B4、B5、B8、B10聚類在一起，推測B1、B2、B3與福云6號(B11)親緣關(guān)系較近；金牡丹(C11)及其所有自然雜交后代都聚類在一起(iii)，說明其后代遺傳組成主要來自于母本金牡丹；金觀音(D11)與D2、D4、D5、D6、D8聚類在一起(iv)，推測其與母本金觀音親緣關(guān)系較近；9個材料紫玫瑰自然雜交后代聚類在一起(v)，卻沒有和親本(E11)聚類在一起，推測父本為同一類型材料，且遺傳組成主要來自于父本；7個悅茗香自然雜交后代與悅茗香(F11)聚類在一起(vi)，說明其后代遺傳成分主要來自于母本悅茗香；武夷山種質(zhì)資源G1、G3、G4、G6、G10、H1、H2、H3、H10、與肉桂聚類在一起(vii)，推測與肉桂親緣關(guān)系較近；武夷山地方資源G5、H6、H8、H5、H11與大葉烏龍(L2)、梅占(L5)、矮腳烏龍(L8)、白芽奇蘭(L10)聚類在一起(viii)，武夷山種質(zhì)資源與這些品種遺傳組成較為相似；武夷山種質(zhì)資源H7與所有參試材料都沒有聚類在一起，說明H7遺傳組成相對特殊。

2.2 群體間遺傳多樣性比較與親緣關(guān)系分析

從表3中看出，Shannon遺傳多樣性指數(shù)最高的為群體7、群體8(武夷山茶樹種質(zhì)資源)，且高于群體9(福建省茶樹品種)；6個自然雜交后代群體遺傳多樣性指數(shù)最高的是福云6號自然雜交后代，推測是由于母本福云6號有云南茶樹種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)，遺傳多樣性相對廣泛；白雞冠、悅茗香、紫玫瑰的自然雜交后代群體遺傳多樣性相當，略高于金觀音、金牡丹的遺傳多樣性指數(shù)。

圖1 遺傳相似系數(shù)聚類圖Fig.1 Dendrogram on genetic similarity

Hardy-Weinberg遺傳偏離指數(shù)D主要反映Ho(觀測雜合度)和He(期望雜合度)之間的平衡關(guān)系，D值越接近0，基因型的分布就越接近于平衡狀態(tài)，D值大于0說明存在雜合子過剩，D值小于0，說明存在雜合子缺失現(xiàn)象[23]。從表3可以看出，6個自然雜交后代群體Ho高于對應的He，D值大于0，屬于親本單一，雜合子過?，F(xiàn)象；武夷山2個地方種質(zhì)資源群體Ho低于對應He，D值小于0，屬于試驗材料有限雜合子缺失現(xiàn)象。

從群體聚類圖2看出，群體1、群體6、群體7與群體8聚類在一起，說明這4個群體親緣關(guān)系相對較近，悅茗香自然雜交后代群體的父本可能來自于閩北武夷山茶樹種質(zhì)資源；群體2、群體9、群體3與群體4聚類在一起，推測福云6號自然雜交后代群體的父本可能來自于閩南鐵觀音、黃棪等高香茶樹種質(zhì)資源。

2.3 94個材料群體結(jié)構(gòu)分析

采用Struture 2.3.4軟件對94個茶樹品種(系)進行系統(tǒng)解析，當K=3時△K值為最大值，從圖3中看出，94個茶樹品種(系)分為3個類群。參考劉志齋[24]等以類群屬性比率50%為標準的劃分依據(jù)，94個茶樹品種(系)分為S1、S2、S3類群，S1類群從品種來源看，代表性材料為黃棪、鐵觀音，主要材料為金觀音及其自然雜交后代、金牡丹及其自然雜交后代，體現(xiàn)的是黃棪、鐵觀音等閩南高香資源類群屬性；S2類群從品種來源看，代表性材料為白雞冠、福云6號、福鼎大白茶、悅茗香，主要材料為白雞冠、福云6號、紫玫瑰與悅茗香自然雜交后代，體現(xiàn)的是烏龍茶與綠茶資源的混合類群屬性；S3類群從品種來源看，代表性材料為肉桂、矮腳烏龍，主要材料為武夷山茶樹種質(zhì)資源，體現(xiàn)閩北優(yōu)異烏龍茶種質(zhì)資源屬性(詳見表4)。

表3 9個群體遺傳多樣性

圖2 群體遺傳相似系數(shù)聚類圖Fig.2 Dendrogram on genetic similarities of groups

圖3 假設(shè)K=3時群體按照所估計的成分(Q)值的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.3 Membership coefficients of 3 clusters based on assumption of cluster number (k=3) and accessions sorted by individuals

表4 94個材料的群體結(jié)構(gòu)

(續(xù)表4)

第一類群鐵觀音、黃棪第二類群白雞冠、福云6號、福鼎大白茶、悅茗香第三類群肉桂、矮腳烏龍代號組成1組成2組成3代號組成1組成2組成3代號組成1組成2組成3C90.98540.00760.007B70.38050.57460.045H100.01010.010.9799D10.57590.41090.0131B80.40320.59020.007H110.0070.01150.9815D110.95390.03470.0114D100.36220.55420.084H20.02610.01550.9584D20.98650.00750.006E10.15740.80540.037H30.0080.01040.9816D30.98530.00790.0069E100.04040.94590.014H40.01250.08860.8989D40.98550.00850.006E20.05540.93090.014H50.01480.01790.9674D50.98550.00840.0061E30.17420.56510.261H60.01140.01590.9727D60.97340.01820.0084E40.15630.82420.02H70.0120.04350.9445D70.98460.00930.0061E50.15710.83070.012H80.0070.01420.9788D80.98590.0080.0061E60.17270.80780.02H90.00930.15720.8335D90.9840.00910.0069E70.05210.92940.019L100.46150.02040.5181E110.68540.18570.1289E80.33910.64090.02L20.11750.18890.6937F70.58810.24860.1633E90.03440.95540.01L90.14610.34850.5054L110.76330.19550.0412F10.02180.83820.14L80.46680.02560.5076L30.58060.30430.1151F100.0070.92750.066平均值0.057290.04560.8971074L40.94260.03360.0237F110.01250.70370.284L50.53790.1320.3301F20.0110.96440.025平均值0.87040.0770930.0525F40.00990.9790.011F50.01190.96450.024F60.0080.91490.077F80.0190.95090.03F90.03080.9430.026L10.01650.89940.084L60.01050.93980.05平均值0.11820.8360.05

3 討論

3.1 武夷山種質(zhì)資源初步鑒定

武夷山茶樹種質(zhì)資源豐富，據(jù)歷史記載有1187種，其中鐵羅漢、水金龜、白雞冠、半天妖等四大名樅就是從武夷山的菜茶中選出[25]，武夷菜茶在世界茶樹植物學分類學上占有重要地位，被稱為武夷種、武夷亞種或武夷變種[26]。劉振[27]、朱晨[28]、姜燕華[29]分別對福建茶樹種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，Shannon多樣性指數(shù)平均值分別為1.16、0.368、0.877，本試驗中2個武夷山茶樹種質(zhì)資源群體的Shannon多樣性指數(shù)平均值分別為1.219、1.136，參試武夷山茶樹種質(zhì)資源群體遺傳多態(tài)性相對最豐富；武夷山種質(zhì)資源2個群體間沒有明顯的差異性，群體親緣關(guān)系較近；22個資源主要分為2個類型，第1個類型9個材料與肉桂親緣關(guān)系較近，第2個類型5個材料與大葉烏龍(L2)、梅占(L5)、矮腳烏龍(L8)、白芽奇蘭(L10)構(gòu)成的小群體聚類在一起，遺傳組成較相似；其中，武夷山種質(zhì)資源H7與所有參試材料都未聚類在一起，推測參試材料H7遺傳基礎(chǔ)較為特殊，需進一步觀察與試驗。

3.2 6個自然雜交后代初步鑒定

白雞冠自然雜交后代遺傳基礎(chǔ)與白雞冠多相一致；紫玫瑰自然雜交后代未與紫玫瑰聚類在一起，推測其遺傳基礎(chǔ)受父本影響較大；悅茗香自然雜交后代遺傳組成與悅茗香一致，群體與武夷山地方資源親緣關(guān)系較為接近，推測悅茗香自然雜交后代的父本是武夷山種質(zhì)資源類型；福云6號自然雜交后代分為2種類型，第1個類型3個材料與福云6號聚類在一起，遺傳組成偏向綠茶，另外6個材料與鐵觀音、黃棪等高香烏龍茶品種聚類在一起，推測其父本為鐵觀音、黃棪等高香烏龍茶品種資源；金觀音、金牡丹及自然雜交后代與鐵觀音、黃棪屬于1個類型。