胃液長鏈非編碼RNA RMRP的檢測及其臨床價(jià)值分析

周善學(xué) 朱春霞 陸蓉丹 邵永富 葉國良

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是 一類轉(zhuǎn)錄本長度＞200個(gè)核苷酸并且不具備蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子。LncRNA以RNA的形式在表觀遺傳學(xué)水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面調(diào)控基因的表達(dá)，是重要的基因表達(dá)調(diào)控元件[1-2]，參與染色質(zhì)重構(gòu)、細(xì)胞分化、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA選擇性剪切等過程[3-4]。在前期研究中，本課題組采用芯片分析了胃癌lncRNA表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)線粒體RNA處理核糖核酸內(nèi)切酶RNA組份（RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease，RMRP）在胃癌組織中表達(dá)水平顯著改變。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測RMRP在不同患者胃液中的水平及變化規(guī)律，結(jié)合臨床病理因素探討胃液RMRP作為胃癌篩查標(biāo)志物的臨床價(jià)值，并通過聯(lián)合比較檢測胃液RMRP、癌胚抗原（CEA）和血清CEA在早期胃癌和進(jìn)展期胃癌中的陽性率，以期為胃癌早期篩查提供新思路。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 45例正?；蜉p度胃炎患者胃液、30例胃潰瘍患者胃液、16例慢性萎縮性胃炎患者胃液和39例胃癌（7例早期胃癌、32例進(jìn)展期胃癌）患者胃液標(biāo)本取自2012年9月至2015年1月在本院進(jìn)行胃鏡檢查的患者，且均經(jīng)病理檢查證實(shí)。所有患者胃鏡檢查前均空腹8h，檢查前2周內(nèi)未接受任何藥物治療。上述新鮮胃液標(biāo)本采集后保存在-80℃冰箱中備用。腫瘤病理類型參照WHO的胃癌病理學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）胃癌TNM分期（2010年第7版）進(jìn)行TNM分期。本研究經(jīng)寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理道德委員會批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2 總RNA的提取 經(jīng)Trizol LS試劑（美國Invitrogen公司）抽提胃液總RNA，DEPC水復(fù)溶后，用核酸蛋白分析儀測定總RNA濃度，根據(jù)總RNA A260/A280比值和1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳RNA條帶完整性鑒定總RNA質(zhì)量。取10μl總RNA加入GoScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA溶液，加80μl DEPC稀釋后，保存于-20℃冰箱。

1.3 胃液RMRP檢測 采用miScript SYBR Green PCR檢測試劑盒（德國Qiagen公司）對上步的5μl cDNA溶液進(jìn)行qRT-PCR（美國Stratagene公司），內(nèi)參GAPDH mRNA引物序列如下：上游為5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，下游為 5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′；RMRP引物序列如下：上游為5′-ACTCCAAAGTCCGCCAAGA-3′，下游為 5′-TGCGTAACTAGAGGGAGCTGAC-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系為：1μl RMRP特異性擴(kuò)增上下游引物或GAPDH上下游引物，12.5μl Go-Taq?qPCR Master Mix，5.5μl無 RNase水和 5μl cDNA。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；然后94℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共45個(gè)循環(huán)。所有樣本做3個(gè)復(fù)孔。通過對胃液RMRP的PCR產(chǎn)物克隆測序明確了胃液RMRP的存在，采用qRT-PCR檢測胃液RMRP的特異性。本研究采用ΔCt法分析目的RMRP的相對表達(dá)水平。ΔCt=CtRMRP-CtGAPDH。ΔCt數(shù)值越大，則基因表達(dá)水平越低。

1.4 胃液和血清CEA水平檢測 采用ELISA法檢測胃液和血清CEA水平。所有操作過程嚴(yán)格按照CEA定量檢測試劑盒（廣州健侖生物科技有限公司）說明書進(jìn)行。本研究中胃液和血清CEA定量檢測＞10ng/ml視為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法或χ2檢驗(yàn)。繪圖由GraphPad Prism v5.0軟件完成。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正?；蜉p度胃炎、胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎和胃癌患者胃液RMRP水平比較 相對于正?；蜉p度胃炎患者，胃潰瘍患者胃液RMRP水平無明顯變化（P＞0.05），而慢性萎縮性胃炎患者胃液RMRP水平明顯降低，胃癌患者胃液RMRP水平顯著升高（均P＜0.01），見表1。

表1 正常或輕度胃炎、胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎和胃癌患者胃液RMRP水平比較

2.2 胃液RMRP水平與胃癌患者臨床病理因素關(guān)系分析 胃癌患者胃液RMRP水平與患者年齡、幽門螺桿菌感染情況均有關(guān)（均P＜0.05），而與性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤位置、血清CEA水平、糖類抗原（CA）19-9水平等因素均無關(guān)（均P＞0.05），見表2。同時(shí)，筆者構(gòu)建了胃液RMRP的ROC曲線，AUC為0.699；當(dāng)其截?cái)嘀禐?0.592時(shí)，胃液RMRP的靈敏度和特異度分別為0.56 和 0.75，見圖 1。

2.3 不同標(biāo)志物篩查早期胃癌和進(jìn)展期胃癌的陽性率比較 通過聯(lián)合檢測血清或胃液CEA和胃液RMRP，筆者分別檢測了7例早期胃癌和32例進(jìn)展期胃癌的陽性率。結(jié)果顯示，胃液RMRP聯(lián)合血清或胃液CEA篩查胃癌的效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物血清CEA（均P＜0.05），見表 3。

表2 胃液RMRP水平與胃癌患者臨床病理因素分析

3 討論

圖1 胃液RMRP水平診斷胃癌的ROC曲線

胃癌是世界上最常見的腫瘤之一，占腫瘤死亡原因的第3位，每年死于胃癌的人數(shù)約占全球死亡人數(shù)的10.4%[5]。因胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多步驟的過程，涉及到大量的基因參與及復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，胃癌的病理生理機(jī)制迄今尚未完全闡明，其早期診斷及治療受到極大的限制[6]。研究表明lncRNA參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，并通過復(fù)雜的分子機(jī)制對胃癌的侵襲和遷移起著極為重要的作用[7-8]。

RMRP定位于人類染色體9p13.3，全長277個(gè)核苷酸，由10個(gè)不同的亞基及單個(gè)RNA分子組成[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，RMRP絕大部分存在于細(xì)胞核與核仁，仍有小部分存在于線粒體內(nèi)，可在小鼠及人類組織中表達(dá)[11-12]。在線粒體內(nèi)，RMRP充當(dāng)核酸內(nèi)切酶角色，能夠劈開一段從DNA復(fù)制起始點(diǎn)合成的RNA產(chǎn)生一條RNA引物，供線粒體DNA領(lǐng)頭鏈合成用。而在核仁，RMRP通過劈開5.8S rRNA前體上最后的短RNA片段，產(chǎn)生成熟的功能性5.8S rRNA分子[13]。此外，RMRP還能與端粒酶相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄酶形成復(fù)合物而展示出RNA依賴的RNA活性[14]。

RMRP在核糖體合成、細(xì)胞周期調(diào)控和線粒體DNA的復(fù)制中均發(fā)揮一定的作用[9]。在腫瘤領(lǐng)域，研究發(fā)現(xiàn)RMRP的異常表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Shao等[6]發(fā)現(xiàn)胃組織RMRP表達(dá)水平只在胃癌前病變階段和胃癌階段顯著降低，顯示它是胃癌相關(guān)性lncRNA。Meng等[15]發(fā)現(xiàn)RMRP在肺腺癌組織中高表達(dá)，其過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、克隆形成和侵襲，通過調(diào)控miR-26發(fā)揮致癌活性。Park等[9]研究發(fā)現(xiàn)RMRP在許多惡性腫瘤細(xì)胞及結(jié)直腸癌組織、乳腺癌組織中高表達(dá)。由此可見，RMRP是一個(gè)潛在的腫瘤檢測及診治新靶點(diǎn)。

本課題組通過lncRNA芯片檢測了胃癌組織及其配對癌旁組織lncRNA表達(dá)譜的差異[16]，發(fā)現(xiàn)RMRP熒光強(qiáng)度大、差異倍數(shù)高，在組織中的變化趨勢一致，以此作為研究對象，檢測其在胃液中的表達(dá)水平，探究其臨床意義。本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR驗(yàn)證130例患者胃液中RMRP的實(shí)際表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)相對于正?；蜉p度胃炎患者，胃潰瘍患者胃液RMRP水平無明顯變化，而慢性萎縮性胃炎患者胃液RMRP水平顯著降低，胃癌患者胃液RMRP水平顯著升高，證實(shí)了RMRP與胃癌的相關(guān)性，具有作為胃癌篩查標(biāo)志物的潛質(zhì)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)胃組織RMRP表達(dá)水平只在胃癌前病變階段和胃癌階段顯著降低[6]，而胃液RMRP水平在胃癌患者中卻反常性顯著升高。由此推測，胃黏膜細(xì)胞癌變時(shí)細(xì)胞RMRP主動(dòng)分泌加強(qiáng)，而檢測胃液RMRP水平可進(jìn)一步提高胃癌檢出率。

表3 不同標(biāo)志物篩查早期胃癌和進(jìn)展期胃癌的陽性率比較[例（%）]

幽門螺桿菌感染是引起胃癌進(jìn)展的主要原因，與宿主炎癥因子密切相關(guān)，在這一過程中，微環(huán)境的改變可能導(dǎo)致胃癌細(xì)胞發(fā)生隨機(jī)突變，從而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生[17-18]。結(jié)合胃癌患者臨床病理因素，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了RMRP水平與患者年齡、幽門螺桿菌感染密切相關(guān)。由此推測，RMRP可能在胃癌的起始階段發(fā)揮炎癥作用，通過以RNA的形式在表觀遺傳學(xué)水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面調(diào)控基因的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)胃癌的發(fā)生。

胃液來源較為單一，其反映上消化道腫瘤具有顯著優(yōu)勢。通過構(gòu)建胃液RMRP的ROC曲線，發(fā)現(xiàn)AUC為0.699，結(jié)合其靈敏度和特異度分別為0.56和0.75，有較高的臨床診斷價(jià)值。早期診斷是降低胃癌病死率的關(guān)鍵一環(huán)[19]，腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測是提高胃癌檢出率的重要手段。通過聯(lián)合血清或胃液CEA和胃液RMRP，檢測了早期胃癌和進(jìn)展期胃癌的陽性率，發(fā)現(xiàn)胃液RMRP聯(lián)合血清或胃液CEA篩查胃癌的效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物血清CEA，聯(lián)合檢測胃液RMRP、血清CEA和胃液CEA可提高胃癌檢出率。

本研究證實(shí)了胃癌相關(guān)lncRNA的存在，并進(jìn)一步分析了胃癌相關(guān)lncRNA RMRP在胃液中的臨床意義。胃液RMRP作為潛在的早期胃癌篩查標(biāo)志物，為臨床診治胃癌研究提供了新的思路。

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