兔源產ESBLs大腸桿菌耐藥性與優(yōu)勢基因型研究

坤清芳，耿 毅，余澤輝，汪開毓，李亞軍，牟維豪，鄧釗賓，張雨薇

(1四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130;2阿壩州中等職業(yè)技術學校，四川 茂縣 623200)

β-內酰胺類藥物是醫(yī)學臨床抗感染治療中使用最廣的抗生素之一，在獸醫(yī)臨床上也發(fā)揮著極其重要的作用，但隨著藥物的廣泛使用，細菌耐藥現(xiàn)象日益嚴重。目前，細菌對該類藥物耐藥的一個重要機制是產生超廣譜 β-內酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)，ESBLs多數(shù)是由質粒介導的能水解氧亞氨基β-內酰胺類藥物的一類水解酶，伴隨著β-內酰胺類藥物的廣泛應用以及不合理的使用，產ESBLs的菌株也變得越來越常見，并在選擇和進化壓力下產生多種不同的ESBLs基因型和基因亞型菌株[1]。編碼ESBLs的基因還往往與其他耐藥基因共存于同一質粒中，導致細菌產生多重耐藥性[2]。產ESBLs的菌株可通過動物飼養(yǎng)、肉制品加工及食用過程傳遞給人，目前國外已有關于產ESBLs菌株引起疾病暴發(fā)流行的報道[3]。ESBLs 型別眾多，其中主要流行TEM型、SHV型、CTX-M型和OXA型ESBLs。

TEM-ESBLs來源于TEM-1和TEM-2基因序列發(fā)生突變造成1～5個氨基酸改變而形成的一系列酶，目前已發(fā)現(xiàn)200多種亞型；SHV-ESBLs主要來自肺炎克雷伯菌，該類型酶對頭孢噻吩的巰基具有水解作用； CTX-M-ESBLs屬于一類很特別的A類活性位點絲氨酸β-內酰胺酶，近年來CTX-M-ESBLs在全球范圍內快速傳播，已經替代TEM型和SHV 型成為全球最流行的ESBLs；OXA-ESBLs 是近年來數(shù)量迅速增加的一類ESBLs，多數(shù)是由OXA-1、OXA-2和OXA-10基因序列發(fā)生突變造成1個或數(shù)個氨基酸改變而形成的一系列酶，目前已發(fā)現(xiàn)100多種亞型。ESBLs不僅型別眾多，且不同國家或地區(qū)流行的基因型和基因亞型都存在差異。大腸桿菌既是臨床產ESBLs的代表性菌屬，又是重要的人畜致病菌，因此國內外對產ESBLs大腸桿菌開展了大量研究，目前已有雞源、鴨源、豬源和牛羊源產ESBLs大腸桿菌的相關研究報道[4-6]，而有關兔源產ESBLs大腸桿菌的研究卻鮮有報道。本研究以四川省兔源大腸桿菌為研究對象，對其產 ESBLs大腸桿菌耐藥性及優(yōu)勢基因型進行研究，以初步了解四川地區(qū)產ESBLs大腸桿菌菌株的耐藥情況,及ESBLs的優(yōu)勢基因型和基因亞型，為指導臨床合理使用抗菌藥物，以及進一步探討大腸桿菌ESBLs耐藥基因的進化機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 2014-2015年，從四川省雅安、自貢、綿陽、德陽和成都等地區(qū)不同家兔養(yǎng)殖場分離鑒定出大腸桿菌共97株，其中雅安20株、自貢26株、綿陽11株、德陽15株、成都25株，菌株均由四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院病理室保存；大腸埃希菌 ATCC25922購自中國普通微生物菌種保存中心。

1.1.2 主要試劑 MH培養(yǎng)基和LB肉湯培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物有限公司；藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；2×startTaqMix、細菌質粒小提試劑盒，購自天根生化科技有限公司；DNA Marker DL2000 、瓊脂糖，購自TaKaRa公司。

1.2 方 法

1.2.1 產ESBLs菌株篩選 表型檢測采用CLSI推薦的雙紙片法[7]進行操作和判讀。初篩試驗：將受試菌均勻涂布于 MH 瓊脂平板，貼頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)16 h，觀測抑菌圈直徑,滿足CAZ抑菌圈直徑≤22 mm 或CTX抑菌圈直徑≤27 mm的菌株可能為產ESBLs 菌株。確證試驗：將受試菌均勻涂布于 MH 瓊脂平板，貼頭孢他啶(CAZ)、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/Clav)和頭孢噻肟(CTX)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/Clav)2組藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)16 h，若任一組藥物的抑菌圈直徑差≥5 mm，則可判定相應菌株為產ESBLs菌株。

1.2.2 藥敏試驗 采用K-B紙片擴散法進行藥物敏感性試驗。將97株大腸桿菌接種于LB肉湯培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，麥氏比濁法調整菌液細菌含量為1.0×108CFU/mL，將菌液均勻涂布于MH瓊脂平板，貼藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，參照CLSI[7]的標準進行結果判斷。數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，將中介菌株直接歸于耐藥菌株。

1.2.3 ESBLs基因型和基因亞型的檢測 采用PCR反應檢測ESBLs的基因型和基因亞型，參照文獻[8-10]設計引物(表1)，交由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。使用細菌質粒小提試劑盒提取產ESBLs菌株DNA模板。PCR反應體系為25 μL：DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，2×TapPCR Master Mix 12.5 μL，加ddH2O至25 μL。TEM、SHV、OXA基因PCR程序：94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán);72 ℃延伸 7 min。CTX-M基因PCR程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-9基因組PCR程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，52 ℃/55 ℃/50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。反應結束后取5 μL擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將陽性產物送至成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序，將獲得的基因序列用NCBI中的Blast、DNA Star軟件和 MEGA5.1 軟件進行序列對比分析，確定基因型和基因亞型。

表1 ESBLs基因的引物序列Table 1 Primers sequences of ESBLs genes

2 結果與分析

2.1 ESBLs檢測結果

97株兔源大腸桿菌在初篩試驗中，有76株為疑似產ESBLs菌；經確證試驗，76株疑似菌株中有69株被確認為產ESBLs菌，占總菌株數(shù)的71.13%(69/97)，非產ESBLs菌有28株，占總菌株數(shù)的28.87%(28/97)。

2.2 產ESBLs和非產ESBLs菌株耐藥情況比較

產ESBLs和非產ESBLs兔源大腸桿菌菌株的耐藥性比較見表2。

表2 產ESBLs和非產ESBLs兔源大腸桿菌菌株的耐藥性比較Table 2 Comparison of drug-resistance between producing and non-producing ESBLs Escherichia coli strains isolated from rabbits

注：同行數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in each row indicate significant difference (P<0.05).

由表2可知，產ESBLs菌對12種藥物的耐藥率均高于非產ESBLs菌株，其中頭孢西丁、頭孢唑啉、頭孢他啶、阿米卡星和諾氟沙星的耐藥率顯著高于非產ESBLs菌(P<0.05)。產ESBLs菌多重耐藥率極顯著高于非產ESBLs菌，其多重耐藥率分別為100%(69/69)和85.71%(24/28)。

2.3 ESBLs基因型和基因亞型的檢測

2.3.1 基因型檢測 對產ESBLs菌的基因型進行檢測，結果表明，未檢出SHV基因；TEM、CTX-M和OXA基因片段大小分別為861,593和564 bp，與預期結果一致(圖1)。將PCR產物測序結果在NCBI上進行Blast比對，TEM陽性產物序列與GenBank上收錄的基因(登錄號：KT956435.1)相似性介于99%～100%，CTX-M陽性產物序列與GenBank上收錄的基因(登錄號：LC091534.1)相似性介于99%～100%，OXA陽性產物序列與GenBank上收錄的基因(登錄號：KR780477.1)相似性介于99%～100%，表明所擴增的片段為對應的基因。由表3可知，69株產ESBLs菌中檢出TEM基因型43株(占62.32%)、CTX-M基因型44株(占63.77%)和OXA基因型16株(占23.19%)；在69株產ESBLs菌中，44.93%的菌株只攜帶1個ESBLs基因，55.07%的菌株攜帶2個或2個以上的ESBLs基因。

表3 69株產ESBLs兔源大腸桿菌菌株基因型檢出情況Table 3 Detection of genotypes of 69 ESBLs-producing Escherichia coli strains isolated from rabbits

M.DNA Marker；+.陽性對照；-.陰性對照；1～6.分離株M.DNA Marker;+.Positive control;-.Negative control;1-6.Isolated strains

2.3.2 基因亞型檢測TEM亞型：將43株TEM型陽性菌株進行測序，菌株分屬于TEM-57(1株)、TEM-116(2株)和TEM-1(40株)等3種基因亞型，檢出率分別為2.33%，4.65%和93.02%。

CTX-M亞型：對44株CTX-M型陽性菌株進行基因亞型組檢測，檢測到CTX-M-1組陽性菌株9株和CTX-M-9組陽性菌株36株，檢出率分別為20.45%和81.82%，其中1株分離菌同時為CTX-M-1組和CTX-M-9組陽性菌株，未檢測到CTX-M-2組陽性菌株。CTX-M-1亞型組中較流行的基因亞型包括CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-3、CTX-M-15和CTX-M-55等;CTX-M-9亞型組中較流行的基因亞型包括CTX-M-9、CTX-M-14、CTX-M-17、CTX-M-24、CTX-M-27和CTX-M-65等。本研究中，CTX-M-1組陽性菌株分屬于CTX-M-15 (1株)和CTX-M-55 (8株) 2種基因亞型，檢出率分別為2.27%和18.18%；CTX-M-9組陽性菌株分屬于CTX-M-17(1株)、CTX-M-65(6株)和CTX-M-14(29株) 3種基因亞型，檢出率分別為2.27%，13.64%和65.91%。

OXA亞型：將16株OXA型陽性菌株進行測序，菌株分屬于OXA-10(1株)和OXA-1(15株) 2種基因亞型，檢出率分別為6.25%和93.75%。

綜上可知，產ESBLs大腸桿菌菌株分屬于TEM-57、TEM-116、TEM-1、CTX-M-15、CTX-M-55、CTX-M-17、CTX-M-65、CTX-M-14、OXA-10、OXA-1等10個基因亞型，其中TEM-1 亞型、CTX-M-14亞型和OXA-1亞型分別是各基因型的優(yōu)勢基因亞型。

3 討 論

自1983年德國首次發(fā)現(xiàn)產ESBLs菌株以來，世界各地產ESBLs菌株的檢出率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，分布范圍不斷擴大，尤其值得注意的是編碼這些酶的基因不僅可通過接合、轉化以及轉導等方式在細菌間快速擴散，還常常與其他非ESBLs酶耐藥基因整合于同一質粒，導致多種耐藥基因同時隨質粒廣泛傳播，給臨床治療帶來困難，因此開展ESBLs監(jiān)測對指導臨床有效用藥是非常必要的[11-13]。本研究采用CLSI推薦的標準方法對分離自四川省各地區(qū)97株兔源大腸桿菌進行ESBLs表型檢測，檢出率為71.13%，該結果高于西藏地區(qū)雞源大腸桿菌的檢出率25%[14]，廣東省食品動物源大腸桿菌的檢出率19.37%[15]，四川省畜禽源大腸桿菌的檢出率36.83%[5]，而低于青島地區(qū)雞源大腸桿菌的檢出率83.13%[3]的檢測結果，說明不同來源、不同地區(qū)的產ESBLs菌株流行分布存在差異，且此次較高的檢出率提示產ESBLs菌株在四川地區(qū)家兔養(yǎng)殖場中普遍流行。劉保光等[16]發(fā)現(xiàn)，產ESBLs菌株不僅對青霉素類、頭孢菌素類藥物表現(xiàn)出耐藥性，而且還同時對多類藥物表現(xiàn)出較高的交叉耐藥性和多重耐藥性；Yuan等[17]研究表明，80.6%的產 ESBLs 菌株表現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象；曲志娜等[3]研究表明，產ESBLs菌株對多類藥物的耐藥率在80%以上，且產ESBLs 菌的多重耐藥程度顯著高于非產ESBLs 菌。本試驗中產ESBLs菌株對12種藥物的耐藥率均高于非產ESBLs菌株，其中對頭孢西丁、頭孢唑啉、頭孢他啶、阿米卡星和諾氟沙星的耐藥率在產ESBLs菌和非產ESBLs菌中差異顯著(P<0.05)；產ESBLs菌多重耐藥程度顯著高于非產ESBLs菌，該結果與上述研究結果一致，進一步證實了ESBLs基因可能會與其他非ESBLs酶基因整合，導致多藥耐藥的發(fā)生。

ESBLs基因型眾多，其中主要流行的基因型有TEM、SHV、CTX-M和OXA。本試驗中TEM、CTX-M和OXA型基因的檢出率分別為62.32%(43/69)，63.77%(44/69)和23.19%(16/69)，未檢測到SHV基因，該結果與國內其他動物源產ESBLs菌株基因型[3,5,15,17]基本一致，以TEM和CTX-M基因為主要流行基因型。此外，盡管OXA基因的檢出率低于TEM和CTX-M基因的檢出率，但該基因的檢出說明四川地區(qū)兔源大腸桿菌中流行ESBLs基因的多樣性。

TEM-1基因是目前革蘭氏陰性菌中流行范圍最廣、檢出率最高的TEM基因亞型。Paterson等[18]在調查意大利境內某醫(yī)院22株產TEM-ESBLs大腸桿菌時發(fā)現(xiàn)，所有菌株攜帶的TEM基因亞型均為TEM-1亞型；Kiratisin等[19]報道，泰國境內產TEM-ESBLs大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的基因亞型均為TEM-1亞型；Ahmed等[20]檢測了日本廣島區(qū)零售雞肉的69株大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)產TEM- ESBLs菌株的基因亞型均為TEM-1亞型；苑麗等[21]檢測河南地區(qū)雞源大腸桿菌時發(fā)現(xiàn)，產TEM-ESBLs菌株的基因亞型均為TEM-1亞型；曲志娜等[3]研究表明，TEM-1亞型是青島地區(qū)雞源大腸桿菌攜帶的主要TEM基因亞型。本試驗中TEM-1基因的檢出率為93.02%(40/43)，表明TEM-1亞型是四川地區(qū)兔源大腸桿菌產TEM-ESBLs菌株攜帶的主要基因亞型。

CTX-M-ESBLs根據(jù)其氨基酸同源性分為6 個亞型組：CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、CTX-M-25 和CTX-M-45[22]，其中CTX-M-1和CTX-M-9組是研究報道最多的酶類[23]。該類ESBLs在全球不同國家和地區(qū)之間呈現(xiàn)不同的流行趨勢，且不同國家和地區(qū)流行亞型具有很大差異，即使同一國家的不同地區(qū)流行的亞型也復雜多變。據(jù)資料顯示，法國和葡萄牙流行CTX-M-1亞型，西班牙流行CTX-M-14亞型，日本流行CTX-M-18亞型，而中國同時流行CTX-M-14、CTX-M-24、CTX-M-27和CTX-M-65[6]等亞型。本試驗結果顯示，基因亞型組CTX-M-1 組(20.45%，9/44)和CTX-M-9組(81.82%，36/44)同時流行于四川地區(qū)兔源大腸桿菌中，但以CTX-M-9 亞型組為主。苑麗等[21]報道，河南地區(qū)流行的基因亞型為CTX-M-14和CTX-M-65；曲志娜等[3]報道，青島地區(qū)流行的基因亞型為CTX-M-65和CTX-M-55；佟盼盼[9]研究發(fā)現(xiàn)，東北三省和江蘇省流行的基因亞型為CTX-M-15和CTX-M-55。本試驗結果表明，四川地區(qū)最流行的CTX-M基因亞型為CTX-M-14亞型(65.91%，29/44)，其次為CTX-M-55亞型(18.18%，8/44)和CTX-M-65亞型(13.64%，6/44)，該結果與其他地區(qū)報道流行的CTX-M基因亞型不同，進一步說明CTX-M基因亞型的流行分布存在地區(qū)差異。

OXA-ESBLs 對頭孢菌素的水解能力不一，其水解頭孢菌素的能力低于水解青霉素類，是近年來數(shù)量迅速增加的一類 ESBLs。目前研究發(fā)現(xiàn)，國外人源大腸桿菌OXA基因亞型以OXA-2亞型和OXA-10亞型為主，國內則以OXA-1、OXA-2和OXA-10亞型為主[9]。苑麗等[24]報道，河南省雞源大腸桿菌OXA-1亞型的檢出率為22.45%；曲志娜等[3]報道，青島地區(qū)雞源大腸桿菌中OXA-1亞型的檢出率高達47.83%；佟盼盼[9]研究發(fā)現(xiàn)，東三省和江蘇省OXA型基因中以OXA-1亞型為主要基因亞型。本試驗結果顯示，OXA基因的檢出率為23.19%(16/69)，其中OXA-1為主要的OXA基因亞型(93.75%，15/16)。

4 結 論

四川地區(qū)兔源產ESBLs大腸桿菌多重耐藥性顯著高于非產ESBLs大腸桿菌；TEM、CTX-M和OXA基因型的檢出率分別為62.32%，63.77%和23.19%，未檢測到SHV基因型，其中TEM和CTX-M基因型是產 ESBLs大腸桿菌中主要流行的ESBLs基因型，與國內其他地區(qū)流行的基因型一致，但基因亞型存在差異，TEM-1亞型、CTX-M-14亞型和OXA-1亞型分別是各基因型的優(yōu)勢基因亞型。

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