過敏性鼻炎合并哮喘患者血液嗜酸性粒細(xì)胞群中 P物質(zhì)及其受體表達(dá)上調(diào)

臧艷艷，柴文戍，王君靈，張慧云，楊蕊銘，何韶衡

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1. 變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫研究中心；2. 呼吸內(nèi)科，遼寧錦州 121001)

過敏性哮喘是一種以肺組織細(xì)胞浸潤(主要為嗜酸粒細(xì)胞及T細(xì)胞)、黏液過度分泌以及氣道高反應(yīng)性為特征的小氣道炎癥性疾病。過敏性鼻炎，為上呼吸道過敏性疾病，成人鼻炎更易發(fā)展為哮喘[1]。目前的研究認(rèn)為，嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤是過敏性鼻炎和哮喘共同的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[2]。

P物質(zhì)(substance P, SP)源于神經(jīng)組織，是一種神經(jīng)肽，人體的嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均可分泌SP[3]。研究發(fā)現(xiàn)，過敏性鼻炎患者血漿和哮喘鼠模型肺泡灌洗液的SP濃度均顯著升高[4]，SP可通過直接活化其受體誘導(dǎo)鼻炎患者鼻黏膜充血、釋放組胺，提示SP可能參與過敏性氣道疾病。此外，SP可誘導(dǎo)過敏性鼻炎患者的鼻黏膜分泌趨化因子RANTES，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞趨化和遷移，誘導(dǎo)和加重過敏性炎癥反應(yīng)[5]，進(jìn)一步提示SP可能通過嗜酸性粒細(xì)胞參與過敏性氣道疾病。SP主要通過其高親和力NK1受體(neurokinin 1 receptor, NK1R)在炎癥、呼吸和記憶方面發(fā)揮重要作用[6]。有報道稱哮喘患者氣道上皮細(xì)胞SP和NK1R均表達(dá)增加，NK1R阻斷劑可顯著改善哮喘鼠的過敏炎癥反應(yīng)[7]，提示SP可能通過NK1R參與過敏性氣道疾病的發(fā)生。

近年來人們對SP和NK1R在神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的表達(dá)和作用進(jìn)行了深入研究[8-11]，但是SP和NK1R在呼吸疾病尤其是過敏性鼻炎合并哮喘(allergic rhinitis complicated with asthma, AR+AS)患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞中的表達(dá)水平還未見相關(guān)報道。因此，本實驗應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測AR+AS患者外周血經(jīng)不同過敏原刺激后嗜酸性粒細(xì)胞群中SP和NK1R的表達(dá)變化，探討其在疾病發(fā)生過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 BV421耦合的鼠抗人CCR3抗體、Zombie Aqua Fixable Viability kit(死細(xì)胞去除染料)、Fc受體(FcR)阻斷劑、紅細(xì)胞裂解液、高爾基受體阻斷劑(BFA)購自Biolegend(San Diego, CA, USA)；APC耦合的鼠抗人NK1R抗體、APC耦合的鼠IgG3同型抗體購自R&D Systems(Minneapolis, USA)；FITC耦合的兔抗人SP抗體購自Lifespan (Rochester, NY, USA)；FITC耦合的兔IgG同型抗體購自eBioscienceLos (Angeles, CA, USA)；Cytofix/CytopermTM固定/透膜試劑盒購自BD Biosciences Pharmigen(Beldford, MA, USA)；皮膚點刺試驗過敏原購自ALK-ABELLO(Denmark)；蒿草花粉提取液、塵螨提取液和梧桐花粉提取液購自北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責(zé)任公司；PBS緩沖液購自Solarbio(Solarbio, USA)；其他常用的化學(xué)試劑如鹽和緩沖液均為分析純；低溫高速離心機(jī)(Thermo Scientific, USA)，水浴鍋(精宏)，F(xiàn)ACSVerse流式細(xì)胞儀(BD Biosciences, USA)。

1.2 方法

1.2.1 研究對象 本研究募集門診健康人和急性期入院的AR+AS患者進(jìn)行皮膚點刺試驗，選取點刺試驗陽性的19例AR+AS患者和點刺試驗陰性的14例健康人為研究對象；哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2016年中華醫(yī)學(xué)會發(fā)布的支氣管哮喘防治指南[12]，鼻炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2015年中華醫(yī)學(xué)會發(fā)布的變應(yīng)性鼻炎診療指南[13]。實驗要求患者停止服用治療哮喘和鼻炎的藥物至少2周，且所有志愿者至少1月內(nèi)無呼吸道感染癥狀。本研究獲得錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并與每位志愿者簽訂了知情同意書。

1.2.2 收集血液樣本 采集志愿者病史資料(表1)，其中健康人和AR+AS患者的年齡和性別構(gòu)成比均無統(tǒng)計學(xué)差異(表2)；每位志愿者均采集10 mL外周靜脈血于含EDTA抗凝劑的采血管中。

表1 志愿者的一般資料

Tab.1 General information of the volunteers

項目健康人AR+AS塵螨(+)蒿草+梧桐(+)塵螨+蒿草+梧桐(+)AR+AS總計例數(shù)1465819年齡(歲)37(24～50)38(34～56)34(20～54)42.5(11～51)38(11～56)性別(女/男)8/63/32/35/310/9病史(年)08(4～16)6(0.2～9)7(3～20)7.5(0.2～20)發(fā)病年齡(歲)NA30(22～48)27(11～50)31.5(0～47)30.5(0～50)

注：表中年齡、病史和發(fā)病年齡的描述均為中位數(shù)(極小值～極大值)，NA：不適用。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血嗜酸性粒細(xì)群中SP和NK1R的表達(dá) 全血加入BFA與蒿草花粉、塵螨和梧桐花粉過敏原粗提液(每種過敏原粗提液的終質(zhì)量濃度均為0.1 μg/mL和1.0 μg/mL)，37 ℃水浴震蕩孵育1 h；1 200 r/min離心后棄去上清，加入死細(xì)胞去除染料與FcR阻斷劑，避光孵育15 min；加入BV421耦合的鼠抗人CCR3抗體，避光孵育15 min后裂解紅細(xì)胞，離心后用PBS溶液清洗并用固定液固定細(xì)胞；透膜洗液清洗后加入FITC耦合的兔抗人SP和APC耦合的鼠抗人NK1R抗體孵育，再次用透膜洗液清洗后上流式細(xì)胞儀檢測嗜酸性粒細(xì)群中SP和NK1R的表達(dá)。

表2 志愿者的年齡和性別構(gòu)成比

Tab.2 Ratio of volunteers’ age and sex

志愿者資料病例數(shù)健康人AR+ASP性別 男134(30.77%)9(69.23%) 女2010(50.00%)10(50.00%)0.310年齡(歲) <38158(53.33%)7(46.67%) ≥38186(33.33%)12(66.67%)0.304

注：病例數(shù)n<40，性別及年齡采用Fisher確切概率法得出P值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0分析數(shù)據(jù)，用Mann-WhitneyU分析組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AR+AS患者嗜酸性粒細(xì)胞群中SP表達(dá)水平升高 本實驗用流式細(xì)胞術(shù)檢測了不同過敏原刺激下人體外周血嗜酸性粒細(xì)胞群(嗜酸性粒細(xì)胞富集群的設(shè)門方法見圖1)SP的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與健康人對照組相比AR+AS患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中SP+細(xì)胞的比例升高了1.5倍(Z=-2.041，P=0.041)。此外，用質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL蒿草花粉粗提液刺激患者外周血后，SP+細(xì)胞的比例上調(diào)約68.1%(Z=-2.637，P=0.008，圖2、圖3)。

圖1 嗜酸性粒細(xì)胞群的設(shè)門方法

Fig.1 Gating strategies of eosinophil-enriched population

A：細(xì)胞碎片去除后的細(xì)胞群；B：死細(xì)胞去除后的細(xì)胞群；C：粒細(xì)胞群；D：嗜酸性粒細(xì)胞群(CCR3+細(xì)胞群)。

圖2 人體外周血嗜酸性粒細(xì)胞群中SP+細(xì)胞的百分比

Fig.2 Expression of SP+cell in eosinophil-enriched population from human blood

蒿草：蒿草花粉粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；塵螨：塵螨粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；梧桐：梧桐花粉粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；AR+AS：過敏性鼻炎合并哮喘；與相對應(yīng)的靜息狀態(tài)健康人對照組比較，**P<0.05；與靜息狀態(tài)的過敏性鼻炎合并哮喘患者組比較，*P<0.05。

2.2 AR+AS患者嗜酸性粒細(xì)胞群中NK1R表達(dá)升高 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同過敏原刺激下人體外周血NK1R+嗜酸性粒細(xì)胞的百分比和平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，與健康人對照組相比，AR+AS患者嗜酸性粒細(xì)胞群中NK1R+細(xì)胞的比例和平均熒光強(qiáng)度分別上調(diào)26.4%(Z=-3.207，P=0.001)和85.9%(Z=-4.774，P<0.001)，而加入不同過敏原NK1R+細(xì)胞的比例及平均熒光強(qiáng)度均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4～圖7)。

圖3 人體外周血嗜酸性粒細(xì)胞群中SP表達(dá)水平的流式細(xì)胞儀代表圖

Fig.3 Representative flow cytometric graphs of expression of SP in eosinophil-enriched population from human blood

Isotype：同型對照；AR+AS：過敏性鼻炎合并哮喘；蒿草：蒿草花粉粗提液。

圖4 人體外周血嗜酸性粒細(xì)胞群中NK1R+細(xì)胞的百分比

Fig.4 Expression of NK1R+cells in eosinophil-enriched population from human blood

蒿草：蒿草花粉粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；塵螨：塵螨粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；梧桐：梧桐花粉粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；AR+AS：過敏性鼻炎合并哮喘；與相對應(yīng)的靜息狀態(tài)健康人對照組比較，**P<0.05。

圖5 人體外周血嗜酸性粒細(xì)胞群中NK1R表達(dá)水平的流式細(xì)胞儀代表圖
Fig.5 Representative flow cytometric graphs of NK1R expression in eosinophil-enriched population from human blood

Isotype：同型對照；AR+AS：過敏性鼻炎合并哮喘。

圖6 人體外周血嗜酸性粒細(xì)胞群中NK1R+細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度

Fig.6 Mean fluorescent intensity of NK1R+cells in eosinophil-enriched population from human blood

蒿草：蒿草花粉粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；塵螨：塵螨粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；梧桐：梧桐花粉粗提液(0.1和1.0 μg/mL)；AR+AS：過敏性鼻炎合并哮喘；與相對應(yīng)的靜息狀態(tài)健康人對照組比較，**P<0.05。

圖7 人體外周血嗜酸性粒細(xì)胞群中NK1R+細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度的流式細(xì)胞儀代表圖

Fig.7 Representative flow cytometric graphs of mean fluorescent intensity (MFI) of NK1R+cells in eosinophil-enriched population from human blood

Isotype：同型對照；AR+AS：過敏性鼻炎合并哮喘。

3 討 論

支氣管哮喘和過敏性鼻炎均為呼吸道常見的過敏性炎癥疾病，二者常常同時存在(AR+AS)并相互影響，嚴(yán)重威脅人類健康，已成為全球性健康問題。SP是一種強(qiáng)效促炎介質(zhì)，其來源廣泛，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)，可誘導(dǎo)炎性介質(zhì)如細(xì)胞因子、氧自由基、花生四烯酸衍生物和組胺釋放并引起組織損傷，這些炎性介質(zhì)可誘導(dǎo)白細(xì)胞募集并進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，過敏性鼻炎和哮喘性咳嗽患者血漿SP表達(dá)升高[14-15]；本研究中AR+AS患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中SP+細(xì)胞的比例升高，提示升高的血漿SP水平來自嗜酸性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞源SP可能在AR+AS的發(fā)生過程起重要作用。

目前，過敏原與SP在AR+AS發(fā)病過程中的關(guān)系還未見報道?，F(xiàn)有研究顯示，過敏原鼻激發(fā)試驗可通過上調(diào)肺組織SP的表達(dá)從而誘導(dǎo)支氣管高反應(yīng)性[16]，且過敏性炎癥可促進(jìn)豚鼠肺神經(jīng)元中SP的合成[17]，提示過敏原可能通過促進(jìn)SP的表達(dá)參與AR+AS的發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)，蒿草花粉粗提液可誘導(dǎo)AR+AS患者外周血SP+嗜酸性粒細(xì)胞的比例上調(diào)約68.1%，提示過敏原可能通過誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞釋放SP參與AR+AS；然而，由于目前尚缺少過敏原可通過調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)SP參與過敏性疾病的發(fā)病的相關(guān)研究，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

NK1R是SP的高親和力受體，廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中[18]，也表達(dá)于氣道平滑肌細(xì)胞、黏膜下腺細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞[19]。在炎癥的局部微環(huán)境中，SP/NK1R復(fù)合物被視為一個整體來發(fā)揮作用，是諸多疾病的分子基礎(chǔ)[20]；此外，NK1R活化可促進(jìn)T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-17，進(jìn)一步促進(jìn)和放大炎癥反應(yīng)[3]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)AR+AS患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞NK1R表達(dá)增強(qiáng)，而SP可通過與高親和力NK1R和低親和力NK2R、NK3R結(jié)合后刺激多種細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺和脫顆粒，并進(jìn)一步募集淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞進(jìn)而參與過敏性鼻炎發(fā)病[21]，提示SP可能通過嗜酸性粒細(xì)胞表面的NK1R參與AR+AS。有報道稱NK1R受體拮抗劑可消除過敏原誘發(fā)的支氣管高反應(yīng)性[16]，NK1R敲除鼠的鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤減少，過敏性鼻炎的癥狀緩解[22]。結(jié)合本研究的發(fā)現(xiàn)，我們可以推斷嗜酸性粒細(xì)胞源SP可能通過自分泌途徑作用于NK1R誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的釋放，進(jìn)而參與AR+AS發(fā)病，但是否能通過阻斷NKIR的表達(dá)進(jìn)而治療AR+AS，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，嗜酸性粒細(xì)胞是AR+AS發(fā)病過程中的重要效應(yīng)細(xì)胞，過敏原可能是AR+AS發(fā)病的主要誘因，SP和NK1R是AR+AS發(fā)病的重要介質(zhì)。AR+AS患者血液嗜酸性粒細(xì)胞SP和NK1R表達(dá)增強(qiáng)，且SP極有可能通過嗜酸性粒細(xì)胞表面的NK1R參與AR+AS發(fā)病，SP和NK1R有望成為治療AR+AS的新靶點。

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