肝癌患者外周血Th17/Treg細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)及IL-17對肝癌細(xì)胞侵襲的影響

劉 勇 周 彪 曾 金 劉華寶

(重慶市中醫(yī)院肝病科，重慶 400020)

雖然肝癌發(fā)病的分子機(jī)制目前尚不清楚，但已有研究表明免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子在肝癌發(fā)病中發(fā)揮重要作用〔1〕。輔助性T細(xì)胞(Th)17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)同屬于CD4+T細(xì)胞亞群，CD4+T細(xì)胞在白細(xì)胞介素(IL)-6和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β的共同誘導(dǎo)下分化為Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞可特異性分泌IL-17因子，通過與其受體結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮促炎癥作用〔2〕。CD4+T細(xì)胞在TGF-β的誘導(dǎo)下可分化為Treg細(xì)胞，Treg細(xì)胞通過分泌IL-10和TGF-β發(fā)揮免疫抑制作用〔3〕。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在分化過程中關(guān)系密切，在腫瘤患者中，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞存在失衡現(xiàn)象〔4，5〕。目前關(guān)于Th17/Treg細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的失衡在肝癌中的研究較少報(bào)道，因此本研究檢測Th17/Treg細(xì)胞及IL-17、IL-10、IL-6和TGF-β細(xì)胞因子在肝癌患者及正常對照人群血漿中的表達(dá)，并在肝癌細(xì)胞系中探討IL-17對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取住院的40例肝癌患者作為觀察組，其中男23例，女17例，年齡31～72〔平均(57.1±2.3)〕歲。選取同期進(jìn)行健康體檢的40例正常人作為對照組，其中男21例，女19例，年齡32～74〔平均(57.9±2.5)〕歲。兩組患者在年齡和性別分布上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)有可比性。

1.2流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中Th17和Treg細(xì)胞比例 吸取1 ml外周血，與等量的RPMI1640培養(yǎng)基混合均勻，然后加入佛波酯(50 ng/ml)、離子霉素(1 μg/ml)和莫能霉素(2 μg/L)，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中刺激4 h。PBS洗滌后加入CD4單抗(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，混勻后室溫避光孵育30 min。PBS洗滌，每管混合液加入2 ml溶血素，室溫避光孵育10 min以裂解紅細(xì)胞，PBS洗滌后離心棄上清液。加入破膜緩沖液，室溫避光孵育10 min，離心棄上清。Th17細(xì)胞加入抗人IL-17單抗(eBioscience公司)，Treg細(xì)胞加入抗人Foxp3單抗(eBioscience公司)，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2次，加入500 μl PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

1.3酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測細(xì)胞因子表達(dá)水平 將空腹抽取的1 ml外周血置于EDTA抗凝管中，然后離心(3 000 r/min，5 min)，分離血漿，置于-80℃冰箱待用。IL-17，IL-10，IL-6和TGF-β ELISA檢測試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司(IL-17：KGEHC170；IL-10：KGEHC009(H)；IL-6：KGEHC007-1；TGF-β：KGEHC107B)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，將待檢血清按1∶10進(jìn)行稀釋后加入已包被的反應(yīng)孔中，37℃孵育1 h后洗滌，加入100 μl酶標(biāo)抗體，37℃孵育1 h后洗滌，加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育1 h后洗滌，加入顯色液避光孵育30 min，待反應(yīng)終止后用BioRad酶標(biāo)儀檢測在450 nm處的吸光值。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人肝癌細(xì)胞系SMMC7721購自上海中科院細(xì)胞庫(上海，中國)，細(xì)胞培養(yǎng)液包含RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL，NY，USA)，10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和鏈霉素(Gibco-BRL)。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5% CO2，95%濕度的培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前一天取對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶(Gibco-BRL)消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，接種至6孔板，每孔約1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，觀察細(xì)胞匯合率，在70%～90%時(shí)，采取Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific，MA，UAS)轉(zhuǎn)染IL-17 siRNA(5′-CCTCAAAGCTCAGCGTGTC-3′)及陰性對照(5′-UAGCGACU AAACACAUCAAUU-3′)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，上海，中國)，6 h后換液，48 h后提取RNA和蛋白質(zhì)，檢測沉默效率。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子表達(dá)(qRT-PCR) 使用Trizol(Thermo Fisher Scientific)裂解轉(zhuǎn)染后的SMMC7721細(xì)胞，提取總RNA，定量后將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄(Takara，大連，中國)為cDNA，產(chǎn)物保存于-20℃冰箱備用。引物序列：IL-17，正鏈5′-TCAACCGTTCCACGTCACCCTGGAC-3′，負(fù)鏈5′-TCAGCATTCAACTTGAGCTCTCATGC-3′〔6〕；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2：正鏈5′-AAGTCTGAA-GAGCGTGAAGTTTGG A-3′，負(fù)鏈5′-TGAGGGTTGGTGGGATTGGAG-3′；MMP-9：正鏈5′-AGTCCACCCTTGTGCTCTTCCC-3′，負(fù)鏈5′-TCTGCCACCCGAGTGTAACCAT-3′；β-actin，正鏈5′-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3′，負(fù)鏈5′-GTCATA CTCCTGCTTGCTGAT-3′〔7〕。以β-actin作為內(nèi)參。基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。所有qRT-PCR實(shí)驗(yàn)n=3。

1.6免疫印跡(Western blot)檢測蛋白水平 將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞置于細(xì)胞裂解液裂解10 min，13 000 r/min 離心5 min后吸取上清。聚丙烯酰胺凝膠電泳30 μg 蛋白，后250 mA轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白置于聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后加入一抗：IL-17(1∶1 000，CST公司，MA，USA)，MMP-2(1∶500，CST公司)，MMP-9(1∶500，CST公司)，β-actin(1∶8 000，sigma公司，MO，USA)。4℃孵育過夜，TBST洗滌6×10 min后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000，中杉金橋，北京，中國)，室溫孵育2 h，TBST洗滌9×10 min后，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，暗室壓片后在洗片機(jī)上曝光顯影。

1.7Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)8 h。消化細(xì)胞，配成無血清細(xì)胞懸液；基質(zhì)膠用無血清RPMI1640培養(yǎng)基1∶5稀釋，加入上層小室，置于37℃培養(yǎng)箱使之凝固。然后將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，每個(gè)小室加入100 μl無血清細(xì)胞懸液(約3×105個(gè)細(xì)胞)，下室加入600 μl完全RPMI1640培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 h，取出Transwell小室，PBS清洗后用棉棒擦去小室上層的細(xì)胞，PBS再次清洗以去除上層細(xì)胞；在小室的下層加入600 μl 0.1%的結(jié)晶紫染液，染色10 min，洗滌后風(fēng)干，使用UFX-ⅡA型顯微鏡(日本Olympus)拍照，在高倍鏡下隨選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血中Th17/Treg細(xì)胞變化 觀察組外周血中Th17 細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例顯著高于對照組，Th17/Treg比例顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2兩組外周血中IL-17、IL-10、IL-6和TGF-β細(xì)胞因子變化 觀察組外周血中IL-17、IL-10、IL-6和TGF-β表達(dá)水平均顯著高于對照組(均P<0.05)。見表2。

2.3IL-17沉默效果檢測 轉(zhuǎn)染IL-22 siRNA后SMMC7721細(xì)胞系分泌的IL-17及細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的IL-17水平較陰性對照組顯著降低(P<0.05)。見表3、圖1。

2.4沉默表達(dá)IL-17對肝癌侵襲能力的影響 Transwell結(jié)果顯示，沉默IL-17后SMMC7721細(xì)胞侵襲能力(0.19±0.03)與陰性對照組(1.00±0.01)相比顯著降低(t=62.742,P<0.05)。見圖2。

2.5干擾IL-17對肝癌細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)影響 沉默IL-17后，MMP-2和MMP-9表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見表4、圖3。

表1 兩組外周血Th17/Treg細(xì)胞比例

表2 兩組外周血中細(xì)胞因子的表達(dá)

表3 沉默IL-17后表達(dá)水平比較

圖1 沉默IL-17后表達(dá)水平檢測

圖2 沉默IL-17后肝癌侵襲能力檢測(Transwell法)

組別MMP-2MMP-9SMMC7721轉(zhuǎn)染沉默后0.47±0.020.60±0.01陰性對照1.00±0.011.00±0.01t/P值58.059/0.00069.282/0.000

圖3 沉默IL-17后MMP-2和MMP-9表達(dá)水平檢測

3 討 論

乙型肝炎病毒感染是導(dǎo)致肝癌產(chǎn)生的主要危險(xiǎn)因素，機(jī)體感染乙肝病毒后，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)，清除病毒的同時(shí)引起了肝細(xì)胞損傷，肝細(xì)胞反復(fù)的壞死和再生導(dǎo)致肝癌的發(fā)展〔6，7〕。乙型肝炎病毒感染引起的慢性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致肝癌發(fā)生和發(fā)展的主要因素〔8〕。盡管乙肝病毒感染與肝癌的發(fā)展之間的因果關(guān)系已經(jīng)確定，但乙肝病毒誘發(fā)肝癌發(fā)生過程中免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的作用機(jī)制目前尚不明確。前期研究表明，在急性乙肝患者外周血中，Th17 細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例升高且其水平與肝功能有相關(guān)性〔9〕。而在肝癌中，有研究報(bào)道Th17/Treg 平衡與患者預(yù)后密切相關(guān)〔10〕。原發(fā)性肝癌患者手術(shù)后外周血中高水平的IL-17可增加患者早期復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)〔11〕。

本研究結(jié)果顯示，肝癌患者外周血中Th17 細(xì)胞和Treg細(xì)胞較正常人群上升，Th17/Treg比例較正常人群下降同時(shí)IL-17、IL-10、IL-6和TGF-β表達(dá)水平均高于正常人群。這一結(jié)果表明這些細(xì)胞因子的共同作用可能誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞和Treg細(xì)胞的分化并導(dǎo)致了Th17/Treg的失衡。Th17/Treg失衡將無法控制機(jī)體免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致相應(yīng)的免疫性損害。同時(shí)Th17 細(xì)胞比例增加導(dǎo)致其分泌的細(xì)胞因子IL-17增加，IL-17可促進(jìn)某些血管源性細(xì)胞因子表達(dá)以及腫瘤微血管生成，與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和浸潤存在關(guān)系〔12〕。異常增加的Treg細(xì)胞則可破壞CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，同時(shí)其分泌的細(xì)胞因子可以破壞其他免疫殺傷機(jī)制，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞增加〔13〕。本研究表明Th17/Treg及細(xì)胞因子失衡與肝癌發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。

本研究還顯示IL-17在RNA水平及蛋白水平顯著下降。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默IL-17后細(xì)胞侵襲能力明顯下降，提示IL-17可能參與肝癌的發(fā)展過程。沉默IL-17抑制了MMP-2和MMP-9的表達(dá)，表明IL-17可能通過調(diào)控MMP-2和MMP-9進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的侵襲能力。

1楊曉霞，劉翔寧，劉明成，等.肝癌患者體液免疫和細(xì)胞免疫的變化情況〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016；16(22)：4367-9.

2Kleinewietfeld M，Hafler DA.The plasticity of human Treg and Th17 cells and its role in autoimmunity〔J〕.Semin Immunol，2013；25(4)：305-12.

3黃剛哲，姜 華.肝癌大鼠體內(nèi)TH17/Treg失衡及意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2016；36(8)：1828-9.

4Duan MC，Han W，Jin PW，etal.Disturbed Th17/Treg Balance in Patients with Non-small Cell Lung Cancer〔J〕.Inflammation，2015；38(6)：2156-65.

5Wang X，Wang L，Mo Q，etal.Changes of Th17/Treg cell and related cytokines in pancreatic cancer patients〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2015；8(5)：5702-8.

6劉立國，吳健雄.乙肝病毒因素對肝癌肝切除及肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的影響〔J〕.中華肝膽外科雜志，2012；18(5)：398-400.

7劉 輝，王鳳梅，駱 瑩，等.乙肝病毒促進(jìn)肝癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移侵襲力〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2016；36(10)：1393-9.

8Sukowati CH，El-Khobar KE，Ie SI，etal.Significance of hepatitis virus infection in the oncogenic initiation of hepatocellular carcinoma〔J〕.World J Gastroenterol，2016；22(4)：1497-12.

9Feng H，Yin J，Han YP，etal.Regulatory T cells and IL-17(+) T helper cells enhanced in patients with chronic hepatitis B virus infection〔J〕.Int J Clin Exp Med，2015；8(6)：8674-85.

10Liao Y，Wang B，Huang ZL，etal.Increased circulating Th17 cells after transarterial chemoembolization correlate with improved survival in stage III hepatocellular carcinoma：a prospective study〔J〕.PLoS One，2013；8(4)：e60444.

11Wu J，Du J，Liu L，etal.Elevated pretherapy serum IL17 in primary hepatocellular carcinoma patients correlate to increased risk of early recurrence after curative hepatectomy〔J〕.PLoS One，2012；7(12)：e50035.

12Huber M，Heink S，Grothe H，etal.A Th17-like developmental process leads to CD8(+) Tc17 cells with reduced cytotoxic activity〔J〕.Eur J Immunol，2009；39(7)：1716-25.

13Takata Y，Nakamoto Y，Nakada A，etal.Frequency of CD45RO+ subset in CD4+CD25(high) regulatory T cells associated with progression of hepatocellular carcinoma〔J〕.Cancer Lett，2011；307(2)：165-73.