紅鰭東方鲀?cè)垂S弧菌毒力基因檢測(cè)及分型研究

王力+張吉鵬+劉美如+葉仕根+黎睿君+李華+李強(qiáng)

摘要 為探明紅鰭東方鲀?cè)垂S弧菌所攜帶毒力基因的種類對(duì)致病性的影響，以從遼寧地區(qū)患病紅鰭東方鲀中分離得到的24株哈維弧菌為材料，根據(jù)GenBank公布的基因序列，設(shè)計(jì)合成引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）對(duì)7種毒力基因flaB、flaC、toxS、zot、tcpA、tdh和tlh進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，24株哈維弧菌中均檢測(cè)出鞭毛蛋白flaB基因和flaC基因，其余5種基因均未檢測(cè)到。同時(shí)對(duì)24株哈維弧菌進(jìn)行了BOX-PCR擴(kuò)增，結(jié)果將其分為4種基因型，記為A1-A4型。

關(guān)鍵詞 紅鰭東方鲀；哈維弧菌；毒力基因；BOX-PCR

中圖分類號(hào) S965.225 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）02-0237-03

Virulence Genes Detection and BOX-PCR Identification of Vibrio harveyi Strains Isolated from Takifugu rubripes

WANG Li 1 ZHANG Ji-peng 1 LIU Mei-ru 1 YE Shi-gen 1 LI Rui-jun 1 LI Hua 1 LI Qiang 2

（1 Key Laboratory of Mari-culture&Stock Enhancement in North China Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian Liaoning 116023； 2 College of Marine and Biology Engineering，Yancheng Institute of Technology）

Abstract In this paper，we detected virulence genetypes of Vibrio harvey isolated from Takifugu rubripes for further studying its pathogenicity.24 strains of V.harveyi isolated from infected Takifugu rubripes in Liaoning region were used for research.The PCR-primers were designed and synthesized according to the published sequence in the GenBank data.Polymerase Chain Reaction（PCR）was used to detect 7 virulence genes，including flaB，flaC，toxS，zot，tcpA，tdh and tlh.The results showed that both flaB and flaC gene were detected in all 24 strains of V.harveyi，and other 5 virulence genes were not detected.Meanwhile，the results of BOX-PCR indentation showed that 24 strains of V.harveyi were divided into 4 genotypes，respectively named A1-A4.

Key words Takifugu rubripes；Vibrio harvey；virulence gene；BOX-PCR

哈維弧菌（Vibrio harveyi）屬于革蘭氏陰性菌，已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖上的主要致病菌，被哈維弧菌感染的對(duì)象有對(duì)蝦[1]、大黃魚[2]、鱸魚[3]、石斑魚[4]、半滑舌鰨[5]、大菱鲆[6]、鮸魚[7]、鮑[8]、紅鰭東方鲀[9]等水產(chǎn)動(dòng)物，嚴(yán)重危害著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，哈維弧菌致病因子受到廣泛的研究。研究表明，哈維弧菌內(nèi)存在flaB、flaC、toxS、zot、tcpA、tdh和tlh基因，并且毒力基因的分布與分離菌株的來(lái)源有關(guān)[10-11]。同時(shí)，BOX-PCR指紋分析技術(shù)可以反映菌株間基因組的差異，廣泛應(yīng)用于生物多樣性的研究[12]。因此，為了進(jìn)一步探究哈維弧菌的致病機(jī)制，本文在原有工作的基礎(chǔ)上，對(duì)遼寧地區(qū)患病紅鰭東方鲀內(nèi)分離鑒定的24株哈維弧菌進(jìn)行flaB、flaC、toxS、zot、tcpA、tdh和tlh 7種毒力基因的研究，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行BOX-PCR探究，為有效防控紅鰭東方鲀細(xì)菌性疾病及相關(guān)基因疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)哈維弧菌的致病機(jī)制和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2014年對(duì)遼寧地區(qū)紅鰭東方鲀細(xì)菌流行病進(jìn)行為期1年的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀?nèi)晁劳雎瘦^低，主要表現(xiàn)為爛鰭爛尾、體表發(fā)黑，少數(shù)肝臟充血、脾臟腫大、腸道無(wú)食物并充滿積液等。在104條病魚的肝、脾、腎和體表潰爛處共分離到70株細(xì)菌，經(jīng)16S rRNA基因序列分析及哈維弧菌特異性引物PCR擴(kuò)增，共鑒定出24株哈維弧菌，經(jīng)人工感染試驗(yàn)確定其為主要的致病菌，編號(hào)為2HWH001—2HWH024。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 哈維弧菌毒力基因檢測(cè)。選取7種毒力基因，包括flaB、flaC、toxS、zot、tcpA、tdh和tlh，對(duì)哈維弧菌分離株進(jìn)行毒力分析。PCR擴(kuò)增采用25 μL的反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L 4×dNTP 1 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，DNA模版1 μL，引物各0.5 μL，雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。各毒力基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，其序列如表1所示。endprint

PCR反應(yīng)體系25 μL：10×PCR緩沖液5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L 4×dNTP 1 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，DNA模版1 μL，引物各0.5 μL，雙蒸水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，30個(gè)循環(huán)，94℃變性1 min，toxS基因52 ℃退火1 min，zot、tcpA、tlh、flaC基因均58℃退火1 min，tdh基因55 ℃退火1 min，flaB基因50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定（120 V電壓下電泳15 min），在凝膠成相系統(tǒng)下拍照分析。

1.2.2 哈維弧菌 Box分型。選擇通用引物BoxA1R[14]對(duì)24株哈維弧菌進(jìn)行BOX-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：10×PCR緩沖液5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L 4×dNTP 1 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，DNA模版1 μL，引物各0.5 μL，雙蒸水補(bǔ)足25 μL。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性 4 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火 1 min，65 ℃延伸8 min，35個(gè)循環(huán)，最后65 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在凝膠成相系統(tǒng)下拍照分析，用Gel-Pro analyzer分析電泳圖，用Ntsys軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒力基因檢測(cè)

采用7種毒力基因的特異性引物對(duì)24株哈維弧菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1、2所示，可以看出，24株分離株均存在flaB、flaC基因，而toxS、zot、tcpA、tdh和tlh基因均未被檢出。

2.2 BOX-PCR分型

哈維弧菌分離株經(jīng)BOX-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物為2～10條，大小介于100～5 000 bp之間，如圖3所示。經(jīng)聚類分析，24株哈維弧菌可分為4個(gè)基因型，如圖4所示，分別標(biāo)記為A1—A4。其中A1型有10株，分別為菌株2HWH001、2H-WH002、2HWH003、2HWH004、2HWH005、2HWH006、2H-WH008、2HWH009、2HWH010、2HWH012，主要是高溫季節(jié)分離的病菌。A2型有11株，分別為菌株2HWH011、2HWH0-15、2HWH016、2HWH017、2HWH018、2HWH019、2HWH020、2HWH021、2HWH022、2HWH023、2HWH024，主要以低溫季節(jié)分離的病菌為主，且主要分離于魚的內(nèi)臟。A3型只有1株菌，為菌株2HWH-007。A4型有2株，分別為菌株2HWH013、2HWH014。

3 討論

3.1 毒力基因研究

對(duì)哈維弧菌致病機(jī)制的研究證實(shí)不同種弧菌間可能存在同一種毒力基因。這種致病性的強(qiáng)弱差異可能是由弧菌某種或某些可遺傳的毒力因子決定的[14-15]。同時(shí)有研究表明，哈維弧菌分泌的毒力因子胞外酶或溶血素可能對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）的致病性起重要作用[16]。由于對(duì)哈維氏弧菌病認(rèn)識(shí)較晚，對(duì)其毒力因子和致病機(jī)制的研究尚不夠充分。為了初步探索菌株毒力因子與致病性強(qiáng)弱的關(guān)系，本研究選取7種常見(jiàn)的毒力因子進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國(guó)遼寧地區(qū)患病紅鰭東方鲀?cè)垂S弧菌無(wú)論強(qiáng)弱毒株都未攜帶toxS、zot、tcpA、tdh和tlh基因，表明遼寧地區(qū)患病紅鰭東方鲀?cè)垂S氏弧菌與這5種毒力因子的相關(guān)度很低；而flaB和flaC基因在24株哈維弧菌中檢出率為100%，筆者分析flaB和flaC基因可能與哈維氏弧菌致病性相關(guān)，具體相關(guān)性還需進(jìn)一步分析。龐玲玲[10]探索了山東青島沿海養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病的鱸魚和大菱鲆等海水養(yǎng)殖動(dòng)物中哈維弧菌的5種毒力基因分布情況，結(jié)果證實(shí)toxS、zot和tcpA基因在哈維弧菌中不是普遍存在的，而flaB和flaC基因分布廣泛，這與本研究結(jié)果有一定的相似性。flaB和flaC基因是編碼鞭毛蛋白的基因，調(diào)控著細(xì)菌附著表面的能力，能夠使哈維弧菌具有很強(qiáng)的附著力[17-18]。結(jié)合紅鰭東方鲀發(fā)病臨床癥狀和毒力基因檢測(cè)結(jié)果，筆者認(rèn)為紅鰭東方鲀爛鰭爛尾病的發(fā)病機(jī)制是魚體體表受損后，哈維弧菌附著于創(chuàng)傷處，使傷口發(fā)炎，當(dāng)魚體抵抗力降低時(shí)細(xì)菌侵入到內(nèi)臟，進(jìn)而引起死亡。徐芝亮[19]研究了廣東、海南、廣西地區(qū)患病的海水魚類或水樣中哈維弧菌的毒力基因分布情況，發(fā)現(xiàn)toxS、zot、tcpA、tlh和tdh基因在哈維弧菌分離株中的分布情況與地區(qū)有一定的相關(guān)性，zot基因在廣東分離菌株中分布比較廣泛，toxS基因在廣西和廣東分離菌株出現(xiàn)較頻繁，tdh基因則廣泛出現(xiàn)在海南分離菌株中，而tcpA和tlh基因在3個(gè)地區(qū)的分離菌株中都沒(méi)有檢測(cè)出。劉迪等[20]研究表明南方蝦源哈維氏弧菌無(wú)論毒性強(qiáng)弱都很少攜帶zot和toxS基因，并認(rèn)為菌株的致病性差異可能與其生化特性相關(guān)。研究表明[21-24]，toxS、zot、tcpA、tdh和tlh基因在霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌、溶藻弧菌等分布較多。本研究在遼寧地區(qū)養(yǎng)殖紅鰭東方鲀?cè)垂S弧菌中均未檢測(cè)出toxS、zot、tcpA、tdh和tlh基因，筆者推測(cè)毒力基因與菌株的分離地區(qū)和動(dòng)物源性相關(guān)，但尚需更多研究予以證明。

3.2 BOX-PCR分型研究

BOX-PCR指紋圖譜分析技術(shù)，是根據(jù)BOX插入因子設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增微生物基因組DNA的重復(fù)性片段，使不同大小的DNA片段與位于這些片段之間的序列得到擴(kuò)增，最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性的一種微生物鑒定方法[25]。隨著微生物檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，BOX-PCR技術(shù)在微生物多樣性研究中已得到應(yīng)用[26-28]。本研究通過(guò)引物BoxA1R將24株哈維弧菌分為4型，大部分屬于A1和A2型，其中A1型細(xì)菌主要分離自高溫季節(jié)，A2型細(xì)菌主要分離于低溫季節(jié)，且分離自內(nèi)臟的哈維弧菌大部分屬于A2型，猜測(cè)BOX分型可能與水溫和分離部位相關(guān)，但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。徐芝亮等[29]研究發(fā)現(xiàn)哈維弧菌BOX分型與地域有關(guān)，本研究由于調(diào)查地點(diǎn)距離較近，無(wú)法證實(shí)這一點(diǎn)。林海云等[30]研究顯示，不同地理來(lái)源的青枯雷爾氏菌在BOX-PCR中可擴(kuò)增出各自特異性條帶，指出青枯雷爾氏菌的遺傳分化與地理來(lái)源存在相關(guān)性。Louws等[31]采用BOX-PCR對(duì)多種植物病原體和假單胞菌進(jìn)行分子分型分析，結(jié)果表明，BOX-PCR能很好地反映它們的基因結(jié)構(gòu)，能對(duì)大量菌株進(jìn)行分類分析。有研究表明[32]，BOX-PCR指紋分析技術(shù)更適合于種及種以下水平遺傳多樣性的研究。本文結(jié)果為今后哈維弧菌基因分型提供了一定的參考，同時(shí)也為哈維弧菌疫苗的防治奠定了基礎(chǔ)。endprint

4 參考文獻(xiàn)

[1] 劉問(wèn)，錢冬，楊國(guó)梁，等.南美白對(duì)蝦蝦苗淡化期間發(fā)光病病原研究[J].集美大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004（4）：300-304.

[2] 石亞素，童國(guó)忠，薛超波，等.舟山養(yǎng)殖大黃魚爛尾病中哈氏弧菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2005（3）：267-269.

[3] 張靜，施慧，謝建軍，等.網(wǎng)箱養(yǎng)殖鱸魚內(nèi)臟白點(diǎn)病病原的分離與鑒定[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009（2）：176-182.

[4] 梅冰，周永燦，徐先棟，等.斜帶石斑魚爛尾病病原菌的分離與鑒定[J].熱帶海洋學(xué)報(bào)，2010（6）：118-124.

[5] 陳政強(qiáng)，姚志賢，林茂，等.半滑舌鰨皮膚潰瘍病病原研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2012，36（5）：764-771.

[6] 范文輝，黃倢，王秀華，等.養(yǎng)殖大菱鲆潰瘍癥病原菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].微生物學(xué)報(bào)，2005（5）：665-670.

[7] 張鳳萍，彭志蘭，張健，等.鮸魚弧菌病病原菌（哈維氏弧菌）的分離與鑒定[J].微生物學(xué)報(bào)，2010（3）：304-309.

[8] 陳月忠，黃萬(wàn)紅，蔡清海，等.閩南地區(qū)鮑潰爛病的研究[J].福建水產(chǎn)，2008（4）：31-37.

[9] 王斌，于蘭萍，胡亮，等.紅鰭東方鲀皮膚潰爛病病原菌的分離與鑒定[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2008（2）：352-358.

[10] 龐玲玲.哈維氏弧菌毒力相關(guān)基因的篩查及快速檢測(cè)技術(shù)研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2007.

[11] 徐芝亮.哈維氏弧菌遺傳多樣性分析及毒力相關(guān)基因的檢測(cè)[D].湛江：廣東海洋大學(xué)，2012.

[12] 楊鳳環(huán)，李正楠，姬惜珠，等.BOX-PCR技術(shù)在微生物多樣性研究中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào)，2008（8）：1282-1286.

[13] SECHI L A，DUPRE I，DERIU A，et al.Distribution of Vibrio cholerae virulence genes among different Vibrio species isolated in Sardinia，Italy[J].J ApplMicrobiol，2000，88（3）：475-481.

[14] VERSALOVIC J，SCHNEIDER M，BRUIJN F，et al.Genomic fingerprint of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction[J].Methods in Molecular & Cellular Biology，1994，5（1）：25-40.

[15] SAEED MO.Association of Vibrio harveyi，with mortalities in cultured marine fish in Kuwait [J].Aquaculture，1995，136：21-29.

[16] LIU P C，LEE K C，KOU G H，et al.Isolation of Vibrio harveyi，from Dis-eased Kuruma Prawns Penaeusjaponicus[J].Current Microbiology，1996，33（2）：129-132.

[17] LEE S E，KIM S Y，JEONG B C，et al.A Bacterial Flagellin，Vibrio vuln-

ificusFlaB，Has a Strong Mucosal Adjuvant Activity To Induce Prote-ctive Immunity[J].Infection & Immunity，2006，74（1）：694.

[18] MILLIKAN D S，RUBY E G.Vibriofischeri Flagellin A Is Essential for Normal Motility and for Symbiotic Competence during Initial Squid Light Organ Colonization[J].Journal of Bacteriology，2004，186（13）：4315-4325.

[19] 徐芝亮.哈維氏弧菌遺傳多樣性分析及毒力相關(guān)基因的檢測(cè)[D].湛江：廣東海洋大學(xué)，2012.

[20] 劉迪，房文紅，周紅霞，等.蝦源哈維氏弧菌的致病性與生物學(xué)特性比較分析[J].海洋漁業(yè)，2017，39（2）：197-205.

[21] MILLER V L，MEKALANOS J J.Synthesis of cholera toxin is positively regulated at the transcriptional level by toxR[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1984，81（11）：3471-3475.

[22] SHI L，MIYOSHI S，HIVRA M，et al.Detection of Genes Encoding Cho-lera Toxin（CT），Zonula Occludens Toxin（ZOT），Accessory Cholera Enterotoxin（ACE）and Heat-Stable Enterotoxin（ST） in Vibrio mimicus Clinical Strains[J].Microbiology & Immunology，1998，42（12）：823-828.endprint

[23] RAJA N，SHAMSVDIN M N，SOMARANY W，et al.Detection and mole-cular characterization of the zot gene in Vibrio cholerae and V.alginol-yticus isolates[J].Southeast Asian Journal of Tropical Medicine & Public Health，2001，32（1）：100.

[24] SECHI L A，DUPR？魬 I，DERIV A，et al.Distribution of Vibrio cholerae，virulence genes among different Vibrio，species isolated in Sardinia，Italy[J].Journal of Applied Microbiology，2000，88（3）：475-481.

[25] 劉佳妍，金莉莉，王秋雨.細(xì)菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J].微生物學(xué)雜志，2006（3）：90-93.

[26] 劉洋，隋新華，陳文新.華北及西北地區(qū)巖黃芪根瘤菌的表型及遺傳多樣性[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2005（5）：1088-1094.

[27] TAC？魨O M，AIVES A，SAAVEDRA M J，et al.BOX-PCR is an adequate tool for typing Aeromonasspp[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，2005，88：173-179.

[28] PROUDY I，BOUGI？魪 D，COTON E，et al.Genotypic characterization of Enterobacter sakazakii isolates by PFGE，BOX-PCR and sequencing of the fliC gene[J].Journal of Applied Microbiology，2008，104（1）：26-34.

[29] 徐芝亮，吳灶和，簡(jiǎn)紀(jì)常，等.哈維氏弧菌的分子遺傳多樣性研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2012（9）：1450-1456.

[30] 林海云，車建美，劉波，等.基于BOX-PCR和REP-PCR技術(shù)青枯雷爾氏菌遺傳多樣性分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011（6）：1099-1109.

[31] LOUWS F J，F(xiàn)UIBRIGHT D W，STEPHENS C T，et al.Specific genomic fingerprints of phytopathogenicXanthomonas and Pseudomonas pathov-ars and strains generated with repetitive sequences and PCR[J].Applied & Environmental Microbiology，1994，60（7）：2286.

[32] 張紅俠，馮瑞華，李俊，等.黃土高原地區(qū)大豆根瘤菌的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育[J].微生物學(xué)報(bào)，2010（11）：1466-1473.endprint