五味子乙素對脂多糖誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞炎性損傷的影響及其作用機(jī)制研究

王玲，王鳳萍

五味子乙素（Schisandrin B）是從中草藥五味子中提取的脂素類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及參與免疫調(diào)節(jié)等作用［1］。研究表明，五味子乙素可通過增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)功能而減輕肝損傷［2-3］，通過清除自由基而減輕心肌缺血/再灌注損傷及腦損傷等［4-5］。急性心肌梗死是臨床常見心血管疾病之一，可導(dǎo)致心肌缺血缺氧損傷及心肌重塑，引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡、炎癥、壞死［6］，而心肌細(xì)胞凋亡、炎癥可造成急性心肌梗死進(jìn)一步加重并引發(fā)心肌功能障礙、心力衰竭等，導(dǎo)致患者死亡風(fēng)險升高［7］。胡開永等［8］研究表明，五味子乙素對阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性具有一定保護(hù)作用，但五味子乙素減輕心肌細(xì)胞炎性損傷的具體機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討五味子乙素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞炎性損傷的影響及其作用機(jī)制，以期為五味子乙素的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 心肌H9c2細(xì)胞（購自杭州赫貝科技有限公司），五味子乙素（北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：65205-64-2），胎牛血清（FBS）（Gibco公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：SR01C-657）；DMEM完全培養(yǎng)基（Invitrogen 公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：20171009），八肽膽囊收縮素（CCK8）試劑盒（江蘇科晶生物科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：WST-8），磷脂酰絲氨酸蛋白抗體/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡試劑盒（江蘇凱基生物科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：KGA106）；白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒均購自江蘇科晶生物科技有限公司，生產(chǎn)批號分別為MT1628、MT5416；RIPA裂解液（杭州碧云天公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：HBS0637），二辛酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（杭州碧云天公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：P1527），增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）（上海翊圣生物科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：P00018）；β-actin（生產(chǎn)批號：abs103627）、PI3K（生產(chǎn)批號：abs256107）、Akt（生產(chǎn)批號：abs021054）、p-Akt（生產(chǎn)批號：abs120584）、FoxO1（生產(chǎn)批號：abs201352）、p-FoxO1（生產(chǎn)批號：abs003266）一抗均購自英國Abcam公司，二抗羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（美國LI-COR Biosciences公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：HS20171106）。

1.2 儀器及設(shè)備 BBS-V800單人超凈臺（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），HERAcell 2401細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司生產(chǎn)），HBS-1096A酶標(biāo)儀（上海京工實業(yè)有限公司生產(chǎn)），Attune NxT流式細(xì)胞儀（Thermo Fisher Scientific 公司生產(chǎn)），GenoSens 1850 凝膠成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）。

1.3 心肌H9c2細(xì)胞培養(yǎng)方法 2017 年3月—2018年1月，采用包含10% FBS、1%雙抗溶液的DMEM完全培養(yǎng)基，將心肌H9c2細(xì)胞置于5% CO2、37 ℃恒溫HERAcell 2401細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，待心肌H9c2細(xì)胞生長至90%左右時培養(yǎng)瓶消毒后置于BBS-V800單人超凈臺，棄去舊培養(yǎng)基，加入無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2遍后加入胰酶消化，顯微鏡下觀察心肌H9c2細(xì)胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，離心后棄去舊培養(yǎng)基并加入新鮮培養(yǎng)基吹打心肌H9c2細(xì)胞，按1:3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 分組方法 五味子乙素對心肌H9c2細(xì)胞的毒性試驗結(jié)果表明，150 mg/L五味子乙素對心肌H9c2細(xì)胞無明顯毒性，且采用10、50、150 mg/L濃度梯度的五味子乙素對H9c2細(xì)胞進(jìn)行試驗有望得到最佳結(jié)果，因此本實驗將傳代培養(yǎng)的心肌H9c2細(xì)胞接種于96孔板上并分為正常對照組（A組）、LPS誘導(dǎo)組（B組）、LPS+低劑量五味子乙素組（C組）、LPS+中劑量五味子乙素組（D組）、LPS+高劑量五味子乙素組（E組），細(xì)胞生長貼壁后A組心肌H9c2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，B組心肌H9c2細(xì)胞僅加入含1 mg/L的LPS，C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞在B組基礎(chǔ)上分別加入10、50、150 mg/L五味子乙素，后共同置于 5% CO2、37 ℃恒溫 HERAcell 2401細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 細(xì)胞相對存活率 5組心肌H9c2細(xì)胞經(jīng)處理后棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入10 μl CCK8試劑，置于HERAcell 2401細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，采用HBS-1096A酶標(biāo)儀測定心肌H9c2細(xì)胞吸光度OD值并計算細(xì)胞相對存活率。

1.5.2 細(xì)胞凋亡率 5組心肌H9c2細(xì)胞經(jīng)處理后加入1 μl Annexin-FITC 混勻，后加入 5 μl PI混勻，避光反應(yīng)5 min，采用Attune NxT流式細(xì)胞儀檢測心肌H9c2細(xì)胞凋亡率，第2、4象限心肌H9c2細(xì)胞百分比即為心肌H9c2細(xì)胞凋亡率。

1.5.3 炎性因子含量 5組心肌H9c2細(xì)胞經(jīng)處理后收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測IL-6、TNF-α含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.5.4 PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1 蛋 白 相 對表達(dá)量 5組心肌H9c2細(xì)胞處理后每孔加入200 μl RIPA裂解液并置于冰上充分裂解30 min，以β-actin為參照，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒、免疫印跡法（Western Blot）法檢測并計算心肌H9c2細(xì)胞PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量。每孔加入50 μg心肌H9c2細(xì)胞進(jìn)行凝膠電泳：275 mA恒流下轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂牛奶封閉條帶1 h，一抗孵育：PI3K（稀釋濃度為1:1 000），Akt（稀釋濃度為1:1 000），p-Ak（t稀釋濃度為1:1 000），F(xiàn)oxO1（稀釋比濃度為1:1 000），p-FoxO1（稀釋濃度為1:1 000）；4 ℃搖床上緩慢振搖過夜，Tris-HCl緩沖鹽溶液-吐溫20（TBST）洗膜3次，8 min/次，后將條帶置入二抗羊抗兔IgG溶液（稀釋濃度為1:3 000），常溫?fù)u床上緩慢振搖1 h，ECL顯色后采用GenoSens 1850凝膠成像儀顯影，采用Image J軟件進(jìn)行半定量分析，凝膠電泳結(jié)果見圖1。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（x± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 心肌 H9c2細(xì)胞 PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1蛋白電泳圖Figure 1 Protein electrophoresis of PI3K，Akt，p-Akt，F(xiàn)oxO1 and p-FoxO1 in myocardial H9c2 cells

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞相對存活率 以A組為參照（100%），B、C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率分別為（49.3±5.8）%、（58.6±6.7）%、（67.4±5.9）%、（81.3±7.4）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.32，P＜0.05）；C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率高于B組，D、E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率高于C組，E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率高于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 細(xì)胞凋亡率 A、B、C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋 亡 率 分 別 為（4.6±1.4）%、（46.5±7.6）%、（37.1±5.4）%、（28.4±4.8）%、（19.5±2.7）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.17，P＜0.05）；B、C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率高于A組，C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率低于B組，D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率低于C組，E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率低于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 炎性因子含量 5組心肌H9c2細(xì)胞IL-6、TNF-α含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B、C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞IL-6、TNF-α含量高于A組，C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞IL-6、TNF-α含量低于B組，D、E組心肌H9c2細(xì)胞IL-6、TNF-α含量低于C組，E組心肌H9c2細(xì)胞IL-6、TNF-α含量低于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.4 PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1 蛋白相對表達(dá)量 5組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而5組心肌H9c2細(xì)胞Akt、FoxO1蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；B、C、D組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量低于A組，C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量高于B組，D、E組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量高于C組，E組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量高于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表1 5組心肌H9c2細(xì)胞炎性因子含量比較（，ng/L）Table 1 Comparison of inflammatory cytokines contents in myocardial H9c2 cells in the five groups

表1 5組心肌H9c2細(xì)胞炎性因子含量比較（，ng/L）Table 1 Comparison of inflammatory cytokines contents in myocardial H9c2 cells in the five groups

注：IL-6=白介素6，TNF-α=腫瘤壞死因子α；與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05；與D組比較，dP＜0.05

組別 IL-6 TNF-α A 組 536.3±114.5 84.5±12.6 B 組 1 754.6±294.6a 195.6±26.8a C 組 1 453.5±238.5ab 152.3±23.7ab D 組 1 054.2±204.2abc 120.4±16.5abc E組 687.7±128.1abcd 90.2±14.6abcd F值 16.305 10.329 P值 ＜0.05 ＜0.05

表2 5組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量比較（x± s）Table 2 Comparison of relative protein expression quantity of PI3K，Akt，p-Akt，F(xiàn)oxO1 and p-FoxO1 in myocardial H9c2 cells in the five groups

3 討論

大量臨床研究表明，急性心肌梗死患者體內(nèi)炎性因子表達(dá)水平尤其是梗死心肌IL-6、TNF-α表達(dá)水平明顯升高，而IL-6、TNF-α表達(dá)水平升高可進(jìn)一步導(dǎo)致心肌功能紊亂及心肌細(xì)胞凋亡、壞死［9］。炎性反應(yīng)是包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡、壞死的重要病理改變，降低細(xì)胞炎性因子含量有助于減輕細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率高于B組，D、E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率高于C組，E組心肌H9c2細(xì)胞相對存活率高于D組，表明五味子乙素可有效促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞增殖，且心肌H9c2細(xì)胞相對存活率隨著五味子乙素劑量增大而升高，表現(xiàn)出劑量依賴性；B 、C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量高于A組，C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量低于B組，D、E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量低于C組，E組心肌H9c2細(xì)胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量低于D組，表明五味子乙素可有效抑制LPS誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞凋亡并降低炎性因子含量，且心肌H9c2細(xì)胞凋亡率及IL-6、TNF-α含量隨著五味子乙素劑量增大而降低，亦表現(xiàn)出劑量依賴性。

PI3K/Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路，Akt磷酸 化 為 p-Akt可 引 起 Caspase-3、Caspase-9、Bax的Ser184位點磷酸化而降低凋亡蛋白活性并上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡；此外，PI3K/Akt信號通路還可調(diào)控FoxO1磷酸化并導(dǎo)致其從胞核內(nèi)移出至胞質(zhì)，繼而抑制轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合及細(xì)胞凋亡［10-11］。動物實驗結(jié)果表明，PI3K/Akt/FoxO1信號通路的激活有利于減輕心肌細(xì)胞損傷，而過氧化物酶增殖物激活受體α（PPAR-α）可通過激活PI3K/Akt/FoxO1信號通路負(fù)性調(diào)控心肌細(xì)胞肥大［12］。郭進(jìn)建等［13］研究發(fā)現(xiàn)，康心飲可誘導(dǎo)缺血性心肌病大鼠心肌細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白表達(dá)量升高并激活PI3K/Akt/FoxO1信號通路，誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)下調(diào)及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上調(diào)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，B、C、D組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量低于A組，C、D、E組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量高于B組，D、E組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量高于C組，E組心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白相對表達(dá)量高于D組，表明五味子乙素可有效上調(diào)LPS誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白的表達(dá)，激活PI3K/Akt/FoxO1信號通路，且PI3K、p-Akt、p-FoxO1蛋白表達(dá)量隨著五味子乙素劑量增大而升高，表現(xiàn)出劑量依賴性，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，五味子乙素可有效促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的心肌H9c2細(xì)胞增殖、抑制心肌H9c2細(xì)胞凋亡、降低心肌H9c2細(xì)胞炎性因子含量，有利于減輕細(xì)胞炎性損傷，其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt/FoxO1信號通路有關(guān)；本實驗結(jié)果對臨床采用五味子乙素輔助治療心肌炎等心肌損傷性疾病具有一定參考價值，但本實驗僅為體外細(xì)胞學(xué)研究，尚缺乏動物學(xué)實驗結(jié)果支撐，結(jié)果結(jié)論仍需在今后的研究中進(jìn)一步證實。

作者貢獻(xiàn)：王玲進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；王鳳萍進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理及統(tǒng)計學(xué)處理，進(jìn)行論文的修訂，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；王玲、王鳳萍進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋，負(fù)責(zé)撰寫論文。

本文無利益沖突。