異源表達(dá)海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因提高釀酒酵母脂肪酸含量研究

張曉偉，郭敏瑞，郭慧靜，陳國(guó)剛

(石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000)

Argonaute蛋白在小RNA分子(siRNA、piRNA、miRNA)沉默通路中起到重要的作用，它是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)的核心成分[1]。成熟的小RNA需要被結(jié)合到Argonaute蛋白以及其他相關(guān)蛋白質(zhì)上形成RNA誘導(dǎo)的RISC[2]。RISC可以催化小RNA去抑制mRNA的翻譯或者直接降解靶mRNA，從而實(shí)現(xiàn)小RNA的生理功能[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)，Argonaute蛋白廣泛存在于生物界中，是高度保守的一類蛋白質(zhì)[4]。Argonaute蛋白質(zhì)通常由N末端、PAZ、MID和PIWI 4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，主要結(jié)構(gòu)域是PAZ和PIWI。PAZ結(jié)構(gòu)域含有110個(gè)氨基酸，結(jié)合到siRNA的3′的二核苷酸突出端，是小RNA的結(jié)合位點(diǎn)[5-6]。盡管大多數(shù)種類的小RNA在一定程度上都能和不同類型的Argonaute蛋白結(jié)合，但特定的小RNA與特定的Argonaute蛋白結(jié)合更容易[7]。PIWI結(jié)構(gòu)域是一類生殖系細(xì)胞專一性蛋白，是Argonaute蛋白家族行使切割功能的活性中心，一些Argonaute蛋白質(zhì)的PIWI結(jié)構(gòu)域賦予slicer以內(nèi)切酶的活性，切割并降解靶mRNA[8]。Argonaute蛋白的作用非常廣泛而且極其重要，目前Argonaute蛋白的基本結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)制已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。Argonaute蛋白家族不僅分布的數(shù)量和種類具有物種差異性，而且成員之間所發(fā)揮的生物學(xué)功能也具有特異性[9]。根據(jù)溫劍[10]的研究，作為真核生物的代表，釀酒酵母體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近32種miRNA分子，這些小RNA分子中的大多數(shù)可能與動(dòng)植物細(xì)胞中的小RNA一樣，也是通過(guò)與Argonaute蛋白結(jié)合作用靶mRNA來(lái)影響mRNA的穩(wěn)定性或翻譯，進(jìn)一步調(diào)控生物體的基因表達(dá)。但研究人員發(fā)現(xiàn)，作為RISC核心物質(zhì)存在的Dicer酶和Argonaute蛋白在釀酒酵母中是沒(méi)有的[11]，因此本研究將海洋細(xì)菌Argonaute蛋白基因在釀酒酵母細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，用以研究海洋細(xì)菌Argonaute蛋白的功能。相關(guān)研究表明，在動(dòng)物體中，小RNA中的成員miRNAs參與了脂肪細(xì)胞分化、脂代謝等多種生物過(guò)程調(diào)控，而其自身也受到轉(zhuǎn)錄因子、脂肪細(xì)胞因子和環(huán)境因子等調(diào)控[12]，但這些具有調(diào)控功能的小RNA通常都是和相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮其功能，因此Argonaute蛋白很可能參與脂肪酸代謝通路的調(diào)控過(guò)程。Argonaute蛋白作為RISC的關(guān)鍵蛋白在所有已知的小RNA沉默通路中起到關(guān)鍵作用。在動(dòng)植物中，Argonaute蛋白還具有切割活性，能抑制靶mRNA的翻譯，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后層面具有調(diào)控作用[13]。由此可見(jiàn)，無(wú)論是在復(fù)雜或簡(jiǎn)單的生物體中，Argonaute蛋白和小RNA的相互作用都是普遍存在且具有特殊功能的。多種動(dòng)植物和真菌的Argonaute蛋白基因已被克隆并驗(yàn)證了功能，并且已有的研究主要集中在高等的動(dòng)植物中[14-15]。目前，關(guān)于海洋細(xì)菌的Argonaute蛋白功能性研究鮮有報(bào)道，尤其是海洋細(xì)菌Argonaute蛋白能否通過(guò)與miRNA結(jié)合從而對(duì)脂肪酸代謝產(chǎn)生調(diào)控作用還尚未被研究。海蘇特氏菌(Joostellamarina)是一種從海水中分離出來(lái)的海洋細(xì)菌，其基因組中包含Argonaute蛋白基因。為了克隆和表達(dá)Jm-Argonaute蛋白基因并驗(yàn)證其對(duì)釀酒酵母脂肪酸的影響，本研究克隆了含有SIR2和Piwi結(jié)構(gòu)域的海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因，并構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至釀酒酵母BY4742細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，分析該蛋白對(duì)酵母脂肪酸含量和種類的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為研究Argonaute蛋白提供了新的思路，也為進(jìn)一步探究Argonaute蛋白在釀酒酵母脂肪酸合成和分解代謝過(guò)程中的作用，進(jìn)而為應(yīng)用基因工程技術(shù)改造釀酒酵母脂肪酸代謝途徑，用以生產(chǎn)油脂的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒以及引物設(shè)計(jì) 海蘇特氏菌(Joostellamarina)購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，按照說(shuō)明書復(fù)蘇并活化菌株，使用海洋細(xì)菌培養(yǎng)基2216E在30 ℃條件下培養(yǎng)。釀酒酵母細(xì)胞表達(dá)載體pCRCT由本實(shí)驗(yàn)室保存。所有的大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自青島擎科生物技術(shù)有限公司，釀酒酵母細(xì)胞BY4742由國(guó)家海洋局第一海洋研究所饋贈(zèng)。研究中所涉及到

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

的野生型菌株、重組菌株以及原始質(zhì)粒和重組質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室完成，由青島擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證正確性，結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到的引物均由本實(shí)驗(yàn)室自己設(shè)計(jì)，由青島擎科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)中用到的所有引物Table 2 All of the primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基 所有的大腸埃希菌DH5α(TSINGKE China)均用LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L)在37 ℃下培養(yǎng)，并按照劑量要求加入100 mg/L的氨芐抗生素。釀酒酵母BY4742(國(guó)家海洋局第一海洋研究所饋贈(zèng))保種從-80 ℃取出，并轉(zhuǎn)接至5 mL YPD液體培養(yǎng)基(葡萄糖 20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L)過(guò)夜活化。然后轉(zhuǎn)接2 mL菌液至100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，將突變菌株與對(duì)照組OD600 nm值調(diào)節(jié)至0.2，30 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)72 h，通過(guò)離心和冷凍干燥收集細(xì)胞，-20 ℃保存?zhèn)溆?。URA缺陷型液體培養(yǎng)基：0.8 g/mL URA，調(diào)節(jié)pH值至6～6.5，滅菌后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖。

1.1.3 試劑與儀器TaqDNA聚合酶T5，高保真DNA聚合酶I5均購(gòu)自TaKaRa公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、細(xì)菌質(zhì)粒小提試劑盒、酵母細(xì)胞質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega公司；無(wú)縫克隆試劑盒購(gòu)自青島擎科生物技術(shù)有限公司；DNA maker、蛋白maker、酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂糖等購(gòu)自青島瑞德合益商貿(mào)有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純和色譜純購(gòu)自國(guó)藥?；蛎}沖電轉(zhuǎn)儀(BIO-RAD，USA)。

1.2 方法

1.2.1 Jm-Argonaute基因克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建 依據(jù)NCBI上已有的海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因，使用primer5.0軟件設(shè)計(jì)P1、P2、P3和P4四種PCR引物并送至青島擎科生物技術(shù)有限公司合成。使用細(xì)菌DNA試劑盒提取海蘇特氏菌基因組DNA作為模板，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增目的基因，設(shè)計(jì)引物為目的基因兩端添加核定位信號(hào)，并組裝各表達(dá)原件，最后使用Hieff CloneTM一步PCR無(wú)縫克隆試劑盒將重疊PCR的產(chǎn)物TEF1-Jm-Argonaute-ADH2組裝到pZMG中，得到pZMG-Jm-Argonaute基因表達(dá)載體。

1.2.2 重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 按照基因脈沖電轉(zhuǎn)儀說(shuō)明書，制備釀酒酵母BY4742感受態(tài)細(xì)胞，準(zhǔn)備用于電轉(zhuǎn)化。隨后將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pZMG加入到含有釀酒酵母BY4742感受態(tài)細(xì)胞的1.5 mL微量離心管中，使用基因脈沖電轉(zhuǎn)儀調(diào)節(jié)至真核細(xì)胞脈沖參數(shù)后對(duì)混合后的樣品進(jìn)行電擊，脈沖電擊一次后，立即加預(yù)冷1 mL山梨醇復(fù)蘇釀酒酵母BY4742細(xì)胞，同時(shí)做對(duì)照，30 ℃孵育1 h后涂板30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，用于挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定。

1.2.3 海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因的生物學(xué)信息分析 使用引物P1和P2擴(kuò)增海蘇特氏菌基因組得到3 165 bp的CDS區(qū)片段，經(jīng)測(cè)序鑒定序列正確后與其他生物Argonaute蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用SMART數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析海蘇特氏菌Argonaute蛋白序列的結(jié)構(gòu)域。

1.2.4 重組菌株海蘇Argonaute蛋白的表達(dá) 將鑒定成功的重組菌株單克隆接種于20 mL URA缺陷型液體培養(yǎng)基(含5%的葡萄糖)中，置于恒溫培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)12 h。待OD600值達(dá)到2.0后取5 mL轉(zhuǎn)接至100 mL URA缺陷型液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)(30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)72 h)，取10 mL發(fā)酵菌液超聲破碎(功率30 kW)處理，4 ℃、8 000 r/min離心5 min后分別取上清和沉淀用于SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.5 重組菌株脂肪酸的GC-MS分析 將含有原始質(zhì)粒pCRCT和重組質(zhì)粒pCRCT-Jm-Argonaute的菌株轉(zhuǎn)接至URA缺陷型液體培養(yǎng)基中，將兩組OD600值調(diào)為0.2左右后再同時(shí)于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)72 h，離心并收集菌液，冷凍干燥后置于-20 ℃保存，用于脂肪酸的測(cè)定。參考Leber等[16]方法提取兩株菌的脂肪酸送GC-MS上機(jī)檢測(cè)，GC-MS分析所得脂肪酸含量數(shù)據(jù)均使用成對(duì)樣本均值分析t檢驗(yàn)計(jì)算樣本間的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因的克隆與載體的構(gòu)建

從海蘇特氏菌中克隆了Argonaute蛋白基因，隨后通過(guò)巢式擴(kuò)增得到了海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因的編碼區(qū)，產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，與預(yù)期大小3 156 bp一致。NCBI比對(duì)分析表明該基因包括SIR2 和 Piwi_piwi-like_ProArk結(jié)構(gòu)域。對(duì)片段長(zhǎng)度為3 156 bp的海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證。使用DNA man軟件分析表明，海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因編碼1 052 bp氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量約為121.467 kDa。利用Hieff CloneTM一步PCR無(wú)縫克隆試劑盒將TEF1-Jm-Argonaute-ADH2組裝到pZMG中，得到pZMG-Jm-Argonaute基因表達(dá)載體，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證載體序列正確無(wú)突變位點(diǎn)。

2.2 海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因多重序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)域分析

利用GeneBank對(duì)海蘇特氏菌Argonaute蛋白及其同源序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，為了發(fā)現(xiàn)海蘇特氏菌Argonaute蛋白與其他Argonaute蛋白家族的關(guān)系，將各類Argonaute蛋白家族的代表性成員與其進(jìn)行多重序列比對(duì)，使用Clustal-W進(jìn)行所有Argonaute蛋白質(zhì)序列比對(duì)，通過(guò)鄰接方法，用MEGA v5軟件分析，基于序列比對(duì)構(gòu)建了來(lái)自植物、動(dòng)物、真菌和其他代表性Argonaute蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果表明海蘇特氏菌Argonaute蛋白與動(dòng)植物以及真菌類Argonaute蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，屬于某些細(xì)菌類蛋白家族，這也證明Argonaute蛋白在進(jìn)化上是高度保守的(圖1)。

蛋白結(jié)構(gòu)域在線分析軟件SMART分析表明，海蘇特氏菌Argonaute蛋白不僅具有Argonaute蛋白行使切割活性的Piwi結(jié)構(gòu)域，還具有與壽命通路和基因沉默機(jī)制相關(guān)的SIR2結(jié)構(gòu)域，并且其已被證明可調(diào)節(jié)基因沉默、DNA修復(fù)及酶的代謝。其中研究最多的功能是基因沉默，包括調(diào)控關(guān)鍵基因、使染色體結(jié)構(gòu)域失活、將其包裝成DNA結(jié)合蛋白不可接近的專門染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)等[17]。

2.3 重組菌株目的蛋白的表達(dá)

將構(gòu)建好的重組載體pZMG-Jm-Argonaute電轉(zhuǎn)化至釀酒酵母BY4742感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，分別取上清液和超聲破碎后的沉淀用于SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)沉淀中有1條分子量為120 kD左右的蛋白條帶(見(jiàn)圖2)，與目的蛋白分子量一致，而上清液中無(wú)特異性條帶，這是海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因兩端核定位信號(hào)引導(dǎo)的結(jié)果，對(duì)照菌株無(wú)特異性條帶，證明pZMG-Jm-Argonaute蛋白在核定位信號(hào)的引導(dǎo)下成功在釀酒酵母BY4742細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)。

圖1 Jm-Argonaute蛋白結(jié)構(gòu)域圖示及進(jìn)化樹(shù)分析Fig.1 Jm-Argonaute protein domain and phylogenetic tree analysisA：Jm-Argonaute蛋白結(jié)構(gòu)域: Jm-Argonaute protein結(jié)構(gòu)域包括了SIR2和Piwi-like亞結(jié)構(gòu)域；B：與其他Argonaute蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)育分析: 包括來(lái)自NCBI BLAST 的擬南芥Argonaute蛋白(8),秀麗隱桿線蟲(chóng)Argonaute蛋白(5)和其他文獻(xiàn)中討論的Argonaute蛋白。 進(jìn)化樹(shù)被分為5組( ■ 擬南芥、 ◆ 秀麗隱桿線蟲(chóng)、△ Piwi、● 原核和原始真核生物、○ Jm-Argonaute蛋白)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示了Jm-Argonaute蛋白質(zhì)與其他Argonaute蛋白家族的關(guān)系A(chǔ)：Jm-Argonaute protein domain: Jm-Argonaute protein domain includes both SIR2 and Piwi-like superfamily domains；B：phylogenetic analysis of other Argonaute protein families: Included are Argonaute proteins found using NCBI BLAST from Arabidopsis (eight),Caenorhabditis elegans (five) and others discussed in the literature.The tree has been divided into four groups ( ■Arabidopsis,◆C.elegans-specific,△Piwi,●prokaryote and primitive eukaryote,and ○Jm-Argonaute protein family).Phylogenetic tree indicating the relationship of Jm-Argonaute protein relative to other Argonaute protein families

2.4 重組菌株脂肪酸成分和含量

在計(jì)算釀酒酵母BY4742的脂肪酸含量之前，通過(guò)測(cè)量37種飽和、不飽和脂肪酸甲酯混合物建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，釀酒酵母中脂肪酸主要以合成C14∶0、C16∶0、C16∶1和C18∶1為主[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組菌株和對(duì)照菌株都包含C12∶0、C14∶0、C16∶0、C16∶1 、C18∶0 和C18∶1脂肪酸，這表明Argonaute基因沒(méi)有改變釀酒酵母BY4742脂肪酸的種類。

為了清晰地了解海蘇特氏菌Argonaute蛋白對(duì)脂肪酸代謝的影響，使用GC-MS分析了重組菌株和對(duì)照菌株的脂肪酸成分和含量(表3和圖3)，與帶有原始載體的對(duì)照菌株相比，重組菌株具有更高的總脂肪酸含量，達(dá)到98.8 mg/g。t-檢驗(yàn)結(jié)果表明2株菌在脂肪酸含量上具有顯著性差異(P(T<=t)=0.017<0.05)，同時(shí)不飽和脂肪酸C16∶1的含量提高得最多，具有顯著性差異(P(T<=t)=0.013<0.05)。綜上所述，發(fā)現(xiàn)海蘇特氏菌Argonaute蛋白對(duì)釀酒酵母脂肪酸含量的提高起到了調(diào)控作用，并且主要提高的是不飽和脂肪酸C16∶1的含量。

圖2 海蘇特氏菌Argonaute蛋白表達(dá)Fig.2 Induced expression of Argonaute protein from Joostella marina1.61代表對(duì)照菌株；海蘇代表重組菌株；兩者表達(dá)條件一致1.61 represents the control strain,D represents the mutant strain,and the expression of both is consistent

表3 Jm-Argonaute對(duì)釀酒酵母BY4742成分和含量的影響Table 3 Affection of Jm-Argonaute on the composition and content of S.cerevisiae BY4742

注：a代表100 mg的干燥粉末樣品用于計(jì)算脂肪酸含量；b代表每個(gè)樣品做3組生物學(xué)平行并且數(shù)值加減誤差值(n=3)

圖3 Jm-Argonaute對(duì)釀酒酵母脂肪酸含量的影響Fig.3 Ffatty acid content in Mutant and wild S.Cerevisiae“*”代表兩組間具有顯著性差異“*”represents a significant difference between the two groups

3 討 論

釀酒酵母脂肪酸代謝涉及兩個(gè)過(guò)程：脂肪酸生物合成和分解代謝過(guò)程。其中包含不同的輔酶因子和催化酶。相關(guān)研究表明，在脂肪酸生物合成途徑中，各種飽和以及不飽和脂肪酸的形成受到不同酶的調(diào)節(jié)，例如乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸延長(zhǎng)酶、脂肪酸去飽和酶等[19]。與脂肪酸合成途徑不同，脂肪酸分解代謝是釋放能量的過(guò)程，特別是β-氧化通路最為重要，但此過(guò)程也需要與脂肪酸分解相關(guān)的酶系統(tǒng)參與，如?；o酶A合成酶和肉堿?；D(zhuǎn)移酶等[20]。根據(jù)本研究結(jié)果，推測(cè)與脂肪酸代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶基因與其調(diào)節(jié)因子可能在海蘇特氏菌Argonaute蛋白參與的小RNA基因轉(zhuǎn)錄后R 調(diào)控中受到調(diào)節(jié)，從而影響了與釀酒酵母脂肪酸代謝相關(guān)的生物通路，進(jìn)一步影響了釀酒酵母脂肪酸的含量，但是具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。雖然一些miRNAs具有調(diào)節(jié)脂類代謝的功能[21]，但是作為小RNA調(diào)控脂肪酸代謝通路中的重要參與者，Argonaute蛋白在其中的具體功能尚不清楚，這有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

本研究分離純化并鑒定了海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因，SMART軟件分析顯示其結(jié)構(gòu)域包含與細(xì)胞壽命相關(guān)SIR2結(jié)構(gòu)域[22]，這在以往的Argonaute蛋白基因研究中未被報(bào)道，SIR2結(jié)構(gòu)域的存在不僅是Argonaute蛋白基因一個(gè)新的序列，也表明本研究中得到的海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因在進(jìn)化水平上可能與以往的Argonaute蛋白基因不同，為深入研究不同生物Argonaute蛋白進(jìn)化關(guān)系提供了新的信息。本研究中，重組酵母飽和脂肪酸占總脂肪酸的百分比含量與對(duì)照菌株無(wú)明顯變化，但不飽和脂肪酸的百分比含量由對(duì)照的86.4%上升至90.5%(數(shù)據(jù)中未顯示)，其中重組菌株脂肪酸C16∶1的含量與對(duì)照菌株有顯著性差異(P(T<=t)=0.013 5<0.05)，這證實(shí)海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因可能具有調(diào)控脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)和去飽和的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然表明海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因與釀酒酵母脂肪酸代謝有關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確。

海蘇特氏菌Argonaute蛋白基因不僅具有與長(zhǎng)壽通路和基因沉默機(jī)制相關(guān)的SIR2結(jié)構(gòu)域，并且在釀酒酵母BY4742的脂肪酸代謝途徑中起到了提高含量的調(diào)控作用，這些發(fā)現(xiàn)可能為海洋細(xì)菌Argonaute蛋白在脂肪酸代謝中的功能提供新的研究方向,并且Argonaute蛋白可以作為一種可行的工具用來(lái)研究釀酒酵母中的RNAi通路，需要進(jìn)一步探究海蘇特氏菌Argonaute蛋白對(duì)釀酒酵母BY4742脂肪酸代謝的潛在調(diào)控機(jī)制。