復合酶法優(yōu)化毛竹筍殼多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

劉煥燕，楊 波，李 琴，楊 光

（1.上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海 200093；2.浙江省林業(yè)科學研究院 竹類研究所，杭州 310023）

竹筍屬于禾本科竹亞科，是一種快速增長的多功能林業(yè)植物。在中國、日本和其他亞洲國家，竹筍栽培及食用的歷史悠久，被廣泛應用于建材、家具、紙張、筷子和食物來源等方面[1-3]。浙江是竹子大省，盛產毛竹筍、雷竹。近年來，竹筍的加工模式主要集中在傳統(tǒng)筍保鮮食品和風味筍加工等方面，其利用率僅在30%左右，剩余部分大多被作為廢棄物[4]。研究發(fā)現(xiàn)，筍殼中含有豐富的活性成分，包括多糖、黃酮、色素、甾醇和過氧化物酶等天然產物，筍殼作為竹筍加工剩余物，大量被廢棄，造成了資源的極大浪費，同時帶來了環(huán)境壓力。開發(fā)再利用筍殼資源，提取其有效活性多糖物質，不僅能夠實現(xiàn)筍殼資源的高值化利用，同時在保健食品和醫(yī)藥研究等方面也具有廣闊的應用前景[5-8]。目前，關于植物多糖的提取工藝已有較多研究，其中，熱水浸提法、酸提法、堿提法、酶解法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等是常用的方法[9]。傳統(tǒng)的熱水浸提法多糖得率較低，一定程度上制約了其開發(fā)利用；酸、堿提取法對實驗設備要求較高，易引起多糖結構的改變；物理儀器輔助法操作復雜；酶解法具有專一性強、條件溫和的特點，采用復合酶協(xié)同作用于植物多糖的提取過程，能夠較好地促進多糖的溶出，可極大地提高多糖得率[10-11]。

目前，尚未有關于復合酶法提取毛竹筍殼多糖的相關報道。本研究擬采用響應面優(yōu)化法對復合酶法提取毛竹筍殼多糖的工藝進行優(yōu)化，確定最佳提取工藝，并對其單糖組成、體外抗氧化活性進行探究，以期能夠最大限度地開發(fā)利用筍殼資源，提高產品的附加值，實現(xiàn)生物質資源的高值化，為毛竹筍殼多糖的工業(yè)提取及功能活性的深入研究提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

毛竹筍殼（P. heterocycla）：源自浙江省杭州市徑山鎮(zhèn)。

1.2 儀器與設備

試劑及藥品：葡萄糖標準品、苯酚、三氟乙酸、單糖標品、濃硫酸、95%的乙醇等試劑，均為分析純，購于成都市科龍化工試劑廠；2,2–聯(lián)苯基–1–苦基肼基（DPPH）、1–苯基–甲基–5–吡唑啉酮（PMP）、維生素C（Vc）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白質酶（104U/g）、纖維素酶（3 000 U/g）、果膠酶（2 000 U/g）購于憶諾聯(lián)創(chuàng)生物科技有限公司。

儀器及設備：FW 型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）、HH–ZK6 型恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限公司）、KQ–300DE 型數控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、R–501 型旋轉蒸發(fā)器（上海一科儀器有限公司）、U–1900 型可見分光光度計（日本Hitachi 公司）、DZF–6020 型真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）、DGX–9140 型烘箱（太倉市華利達實驗設備有限公司）、冷凍干燥機（美國Labconco 公司）、CL31R 型多功能高速離心機（美國Thermo 公司）、Sartoriμs BSA224S 型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 毛竹筍殼的預處理

用自來水將新鮮的毛竹筍殼清洗干凈，將其置于55 ℃的烘箱中干燥，之后粉碎，過80 目篩，備用。

1.3.2 毛竹筍殼多糖的復合酶法提取工藝

準確稱取5.0 g 筍殼粉末，在預試驗的基礎上，按照料液比1 ∶ 30（m/V），在設定的不同復合酶添加量（蛋白質酶 ∶ 纖維素酶 ∶ 果膠酶=1 ∶ 1 ∶1）、酶解時間和酶解溫度下進行酶解提取試驗。酶解后得到的多糖浸提液，沸水浴10 min 滅酶，抽濾，混合全部濾液，60 ℃減壓濃縮，濃縮液加入4 倍體積的95%乙醇于4 ℃靜置過夜，5 000 r/min離心10 min，收集沉淀并經凍干得筍殼粗多糖。

1.3.3 多糖得率的測定

采用苯酚硫酸[12]比色法，得到葡萄糖標準曲線為y = 19.59x ? 0.021 6，調節(jié)系數R2= 0.997 3。式中：y 為吸光度；x 為葡萄糖質量濃度（mg/mL）。準確稱取2.0 g 粗多糖蒸餾水定容至100 mL，按照上述標準曲線的操作步驟測定吸光度，根據標準曲線方程，多糖得率計算公式為

式中：m1為凍干樣品的質量；m0為毛竹筍殼質量；w 為多糖含量。

1.3.4 單因素試驗

在自然pH 條件下，按照1 ∶ 30（m/V）料液比加入蒸餾水，探究不同復合酶添加量、酶解時間、酶解溫度對毛竹筍殼多糖得率的影響，提取工藝按照1.3.2 所述。

1.3.5 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，利用Box-Benhnken原理設計三因素三水平的響應面試驗，三因素分別為復合酶添加量、酶解時間、酶解溫度，以多糖得率為響應指標，確定復合酶法提取筍殼多糖的 最佳工藝。各因素及水平編碼見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface test

1.3.6 毛竹筍殼多糖初步純化

將筍殼粗多糖配成1.5 mg/mL 的溶液，加入等體積的Sevag 試劑（氯仿 ∶ 正丁醇 = 4 ∶ 1）充分振搖20 min 后，4 000 r/min 離心10 min，棄去下層有機相，上層水相繼續(xù)進行上述脫蛋白操作，重復4～5 次，直至無明顯的白色沉淀產生[13]。最后收集水相于透析袋（4～6k Da）中，透析2 d 后凍干得到筍殼精制多糖。

1.3.7 毛竹筍殼多糖的單糖組成分析

筍殼多糖的單糖組成采用柱前衍生化反相高效液相色譜法（HPLC）進行分析鑒定[14]。測定條件：檢測波長245 nm；柱溫30 ℃；柱子APS–2 HYPERSIL（4.6×250 mm，5 μm，Thermo，ΜSA）；流速1.0 mL/min；進樣體積10 μL；流動相乙腈 ∶流動相磷酸緩沖液（0.05 M ，pH6.8）=17 ∶ 83[15]。

1.3.8 毛竹筍殼多糖抗氧化活性測定

用蒸餾水配置不同濃度的筍殼多糖待測溶液，取待測溶液1.0 mL 置于試管中，再添加3.0 mL溶于95%乙醇的DPPH 溶液（0.075 mmol/L ），均勻混合，黑暗處放置30 min 后，在波長517 nm 處測吸光值，Vc 溶液為陽性對照[16]。DPPH 自由基清除率的計算式為

式中：A0為空白樣品的吸光值；A1為樣品溶液的吸光值；A2為以蒸餾水代替DPPH 的吸光值。

羥自由基清除率的測定參考祁小妮等[13]、Mao等[17]的方法稍作修改。取2.0 mL 不同濃度的筍殼多糖待測溶液與2.0 mL FeSO4溶液（9.0 mmol/L）混勻，加入2 mL H2O2溶液（8.8 mmol/L ），搖勻，加入2.0 mL 水楊酸乙醇液（9.0 mmol/L），振蕩混勻后立刻在37 ℃水浴鍋中放置30 min，測定不同質量濃度多糖樣品液在波長510 nm 處的吸光值，Vc 溶液為陽性對照。羥自由基的清除率計算同式（2），其中A2為不加顯色劑H2O2的吸光值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 復合酶添加量對多糖得率的影響

準確稱取10 g 粉碎的毛竹筍殼，按照1 ∶ 30（m/V）料液比添加蒸餾水，提取溫度為50 ℃，分別添加0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的復合酶，酶解60 min，比較復合酶不同的添加量對多糖得率的影響，結果如圖1 所示。

圖1 酶添加量對多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on the extraction rate of polysaccharide

由圖1 可以看出，隨著酶添加量的增加，多糖得率逐漸增加；當添加量達到1.5%后，繼續(xù)增大添加量，多糖得率沒有顯著增加，這可能是在一定提取濃度下，酶濃度已經趨于飽和，多糖幾乎全部溶出，繼續(xù)增加酶用量，對多糖得率沒有顯著影響。因此，在后續(xù)試驗中選取1.5%作為適宜的復合酶添加量。

2.1.2 酶解時間對多糖得率的影響

準確稱取10 g 粉碎的毛竹筍殼，按照1 ∶30（m/V）料液比添加蒸餾水，提取溫度為50 ℃，復合酶添加量為1.5%，分別酶解30，60，90，120，150 min，探究酶解時間對多糖得率的影響，結果如圖2 所示。當酶解時間小于90 min 時，隨著時間的延長，多糖得率逐漸增加，且增加速率較大；當酶解時間超過90 min 后，多糖得率不再增加，反而出現(xiàn)較小程度的下降，這可能是酶解時間過長，少部分多糖出現(xiàn)了分解現(xiàn)象，同時酶的催化活性會降低，不能繼續(xù)增大多糖得率。因此 ，選取90 min 作為適宜的酶解時間。

圖2 酶解時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic time on the extraction rate of polysaccharide

2.1.3 酶解溫度對多糖得率的影響

準確稱取10 g 粉碎的毛竹筍殼，按照1 ∶30（m/V）料液比添加蒸餾水，添加1.5%的復合酶，分別在30，40，50，60，70 ℃條件下酶解90 min，探究酶解溫度對多糖得率的影響，結果如圖3 所示。當酶解溫度在30～50 ℃范圍內，多糖得率逐漸上升，在50 ℃時多糖得率達到最高；溫度高于50 ℃后，多糖得率隨著溫度升高呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，這種現(xiàn)象可能是由于酶本身的特性引起的，酶具有最適反應溫度，溫度過低會抑制其活性，溫度過高會導致其失去活性。因此，確定 出適宜的酶解溫度為50 ℃。

圖3 酶解溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic temperature on the extraction rateof polysaccharide

2.2 響應面試驗設計與結果分析

2.2.1 響應面試驗結果與分析

通過響應面法，對復合酶添加量A、酶解時間B、酶解溫度C 3 個單因素進行分析，得到的試驗方案及數據結果見表2，共有17 個試驗點，其中5 個中心點試驗。利用Design-Expert 軟件對響應面數據進行多元回歸擬合，得到多糖得率Y 的二次回歸擬合曲線方程為

模型的方差與顯著性分析結果如表3 所示。

表2 響應面試驗設計與結果Tab.2 Design and results of response surface test

表3 回歸方程的方差分析Tab.3 Variance analysis of the regression equation

可以看出，該模型概率值P < 0.000 1，說明該模型極顯著；失擬項不顯著（P = 0.735 3），說明外界未知因素對試驗的干擾較小；模型決定系數R2= 0.978 3，調整決定系數= 0.950 5，表示該響應面試驗的設計比較合理，建立的模型能夠解釋95.05%響應值的變化，說明毛竹筍殼多糖得率的預測值與實際值能夠較好擬合，試驗誤差較小，可以用此模型對復合酶法提取毛竹筍殼多糖的工藝條件進行分析和預測[18]。比較F 值大小可以發(fā)現(xiàn)，各因素對多糖提取效果的影響程度順序為復合酶添加量>酶解時間>酶解溫度，且在本研究所選取的因素水平范圍內，3 個單因素對多糖得率均有極顯著的影響。

2.2.2 兩因素交互作用分析

復合酶法提取毛竹筍殼多糖工藝中酶添加量、酶解時間和酶解溫度之間的交互作用對多糖得率的影響結果如圖4 所示。一般來講，響應曲面圖的拋物面開口向下，說明具有極大值點；響應曲面圖的陡緩及其等高線圖的形狀可以反映因素兩兩交互效應的強弱，曲面越陡且等高線為橢圓形表示兩因素交互作用顯著，反之則說明交互作用不顯著[13,19]。 從圖4 中可以看出，固定任意1 個因素為零水平，改變其余2 個因素時，隨著二者水平的提高，多糖得率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。相比較而言，隨著酶解時間的延長，多糖得率下降的幅度較小，說明酶解時間對多糖得率的影響不顯著。因素A 與B，A 與C 交互作用的曲面圖較為陡峭，且等高線呈密集的橢圓形，表明酶添加量和酶解時間、酶添加量和酶解溫度之間均有較強的交互作用；因素B 與C 交互作用的曲面圖較緩，等高線趨向圓形，表明酶解時間與酶解溫度之間的交互作用不顯著。以上結果與方差分析結果基本一致。

圖4 各因素交互作用對多糖得率的影響Fig.4 Effect of the interaction between various factors on the extraction rate of polysaccharide

2.2.3 最優(yōu)工藝驗證試驗

利用Design Expert 7.0 軟件對復合酶法提取毛竹筍殼多糖的最佳工藝進行優(yōu)化，得到最佳工藝參數為：復合酶添加量1.6%，酶解時間104.30 min，酶解溫度51.29 ℃。為檢驗響應面法優(yōu)化筍殼多糖提取工藝的可靠性，考慮到實際操作的可行性，調整參數為復合酶添加量1.6%，酶解時間105 min，酶解溫度51 ℃，進行驗證試驗。結果發(fā)現(xiàn)，在該調整工藝條件下多糖得率為1.98%，與模型預測值沒有明顯差異，相對誤差為2.94%。這說明本次研究建立的響應面模型得到的最優(yōu)工藝參數準確性較強。

2.3 筍殼精制多糖的單糖組成

采用HPLC 測定筍殼精制多糖水解產物及10 種單糖標準品，通過比較10 種單糖標準品和樣品衍生物在色譜圖中的保留時間和峰面積，分析確定單糖組成，以及各單糖組成的摩爾比，結果如圖5 所示。筍殼多糖能夠在上述色譜條件下得到有效的分離，其中，Man 為甘露糖；Rib 為核糖；Rham 為鼠李糖；GlcUA 為葡萄糖醛酸；GalUA 為半乳糖醛酸；Glc 為葡萄糖； Gal 為半乳糖；Xyl 為木糖；Ara 為阿拉伯糖；Fuc 為巖藻糖。根據色譜圖中的保留時間與峰面積，可以確定該多糖含有GalUA，Gal，GlcUA，Xyl，Ara 和Glc。其中，Glc 和GlcUA 的含量較低，主要單糖組 分GalUA，Gal，Xyl，Ara 的 摩爾 比為15.35 ∶32.82 ∶ 6.45 ∶ 39.13，可見毛竹筍殼多糖是一種酸性多糖。

圖5 筍殼多糖的單糖組成分析Fig.5 Analysis of the monosaccharide composition of thepolysaccharide

2.4 抗氧化活性結果與分析

2.4.1 DPPH 自由基清除率

毛竹筍殼精制多糖和Vc 對DPPH 自由基的清除效果比較如圖6 所示?？梢钥闯?，毛竹筍殼精制多糖具有顯著的清除DPPH 自由基的能力，且隨著濃度的增加，清除能力逐漸增強；但是Vc清除DPPH 自由基的效果基本保持穩(wěn)定。當質量濃度為0.50 mg/mL 時，精制多糖對DPPH 的清除率已達到50%以上，但Vc 對DPPH 的清除率已高達96.67%。精制多糖的半抑制濃度IC50值為0.47 mg/mL，可見一定質量濃度范圍內的Vc 和筍殼多糖對DPPH 自由基都具有一定的清除效果，且毛竹筍殼精制多糖對DPPH 的清除效果較低于相 同濃度條件下的Vc。

圖6 筍殼多糖對DPPH 自由基的清除率Fig.6 DPPH scavenging rate of the purified polysaccharide

2.4.2 羥自由基清除率

筍殼精制多糖和Vc 對羥自由基的清除效果比較 結果如圖7 所示。

圖7 筍殼多糖對羥自由基的清除率Fig.7 Hydroxyl radical scavenging rate of the purified polysaccharide

由圖7 可知，在質量濃度低于2.0 mg/mL 范圍內，二者對羥自由基的清除能力隨濃度的增大而增大，Vc 清除效果增大的速度較快；當多糖、Vc 質量濃度為2.0 mg/mL 時，Vc 對羥自由基的清除效果基本保持穩(wěn)定，已達到最大值；精制多糖對羥自由基的清除率為33.42%，且隨著濃度的增大，清除效果持續(xù)提高。筍殼精制多糖和Vc 對羥自由基的半抑制濃度IC50值分別為4.00，0.35 mg/mL。綜上分析可以看出，筍殼精制多糖對羥自由基的清除效果稍弱，且呈現(xiàn)出較明顯的質量濃度依賴關系。

3 結 論

選用復合酶法提取毛竹筍殼的多糖，在單因素試驗結果的基礎上，通過Design-Expert 軟件對提取工藝進行了優(yōu)化設計，并建立了數學模型，獲得了筍殼多糖的最佳提取工藝條件：復合酶添加量1.6%，酶解時間105 min，酶解溫度51 ℃。在最優(yōu)條件下的多糖得率為1.98%，與模型預測值基本吻合。通過高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，筍殼精制多糖是一種酸性多糖，主要單糖組分半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖的摩爾比為15.35 ∶32.82 ∶ 6.45 ∶ 39.13?？寡趸钚栽囼灲Y果表明，毛竹筍殼多糖具有一定的DPPH 自由基和羥自由基清除能力，其清除能力與多糖的質量濃度有明顯的量效關系。