不同培養(yǎng)基對春小麥×玉米單倍體胚分化成苗的影響

王 重，樊哲儒，張躍強，李劍峰，高 新，王子霞

(1.新疆農業(yè)科學院核技術生物技術研究所，烏魯木齊 830091；2.農業(yè)部荒漠綠洲作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】使用玉米花粉可以誘導小麥產生單倍體胚，分化后獲得的單倍體植株經(jīng)過加倍可以得到純合雙單倍體[1-3]，該方法與傳統(tǒng)的雜交育種比較能夠有效地縮短育種年限，而且不受基因型制約，也不會產生白化苗，育種應用潛力非常大[4-7]。但是誘導得到的單倍體胚由于胚乳發(fā)育不完全，必須經(jīng)過離體培養(yǎng)方式進行胚拯救方可分化成苗[8, 9]，因此，選擇合適的離體培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)對于提高單倍體植株的獲得效率和加倍效率具有決定性的作用?！厩叭搜芯窟M展】目前廣泛應用于單倍體胚離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基有MS、B5等[10]，但不同學者的研究結果并不一致。Laurie等[2]使用1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA進行培養(yǎng)，幼胚能夠長出嫩芽，但根系生長緩慢，Brazauskas等[11]使用2/3 B5培養(yǎng)基時單倍體胚再生為小麥幼苗的分化率為36. 9%，趙翠榮等[12]研究表明，無激素添加的1/2 MS培養(yǎng)基單倍體胚萌發(fā)率和成苗率均高于B5培養(yǎng)基和添加激素的1/2 MS培養(yǎng)基，陳新民等[9]使用1/2 MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基進行單倍體胚培養(yǎng)，結果表明，B5培養(yǎng)基的幼胚萌發(fā)率略高于1/2 MS培養(yǎng)基，但兩者之間差異不顯著，張闊等[13]研究認為改良的B5培養(yǎng)基對于單倍體胚的培養(yǎng)明顯優(yōu)于1/2 MS培養(yǎng)基，蔡東明等[14]在1/2 MS培養(yǎng)基中添加微量激素可使幼苗產生率達到62.05%，陳淑萍等[15]研究表明1/2 MS培養(yǎng)基中添加2,4-D可使單倍體幼苗生長旺盛，根系發(fā)達，生長素效果為2,4-D>IBA>IAA，高艷等[16]研究認為1/2 MS培養(yǎng)基中添加微量多效唑、KT、肌醇及較高濃度蔗糖能夠有效促進單倍體胚的分化?！颈狙芯壳腥朦c】單倍體胚分化是小麥雙單倍體產生的重要過程，單倍體植株的獲得效率以及生長健壯程度是影響后期加倍處理效率的關鍵因素，目前單倍體胚分化培養(yǎng)基的研究并無統(tǒng)一結論，且多以冬小麥為研究對象，針對春小麥單倍體胚分化的研究鮮見報道。研究不同培養(yǎng)基對春小麥×玉米單倍體胚分化成苗的影響。【擬解決的關鍵問題】以1/2 MS和B5為基礎培養(yǎng)基，結合不同水平激素的添加，分析不同培養(yǎng)基配方對于小麥單倍體胚成苗率的影響，研究適宜新疆春小麥單倍體胚分化成苗的最佳培養(yǎng)基，為進一步將春小麥×玉米遠緣雜交方法應用于育種實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料春小麥單倍體胚由新疆農業(yè)科學院核技術生物技術研究所提供，母本為春小麥材料XC、126H，父本分別為爆裂玉米、甜玉米、糯玉米。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

玉米材料4月上旬覆膜播種，分三期，間隔8 d，小麥材料于4月下旬分兩期播種。小麥抽穗后采用常規(guī)雜交方法整穗、剪穎、去雄、套袋，待柱頭呈現(xiàn)絨毛狀時收集新鮮玉米花粉使用脫脂棉蘸取進行授粉雜交，授粉24 h后，進行第2次授粉，48 h后噴施激素，72 h重復噴施激素。授粉15 d后，將小穗剪下取回，剝出籽粒，使用70%乙醇消毒1 min，無菌水洗滌3次，再用0.1% HgCl2消毒8 min，無菌水洗滌5次，接種于培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7 d，胚萌發(fā)后移至正常光照下培養(yǎng)直至分化成苗。

1.2.2培養(yǎng)基配方

試驗采用小麥組織培養(yǎng)經(jīng)常使用的1/2MS和B5作為基礎培養(yǎng)基，列出添加不同激素(2,4-D、IAA、6-BA)及激素配比的適宜新疆春小麥單倍體胚發(fā)育的培養(yǎng)基配方。表1

表1 培養(yǎng)基配方
Table 1 Medium formula

編號Medium No.培養(yǎng)基配方Medium components蔗糖Sucrose (g/L)瓊脂Agar (g/L)pH值pH value11/2 MS3075.821/2 MS+0.1 mg/L 2,4-D3075.831/2 MS+0.1 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA3075.841/2 MS+0.1 mg/L IAA+0.1 mg/L 6-BA3075.85B53075.86B5+0.1 mg/L 2,4-D3075.87B5+0.1 mg/L 2,4-D+0.1 mg/L 6-BA3075.88B5+0.1 mg/L IAA+0.1 mg/L 6-BA3075.8

1.2.3 計算

根系數(shù)量：單倍體胚接種15 d后長度>0.5 cm根系數(shù)量。

根系最大長度：單倍體胚接種15 d后最長根系長度。

成苗率=幼苗株數(shù)/接種單倍體胚數(shù)×100%。

2 結果與分析

2.1 單倍體胚成苗率

分別使用8種培養(yǎng)基配方，共培養(yǎng)單倍體胚488個，獲得單倍體幼苗323株，成苗率66.19%，其中以1/2 MS為基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)單倍體胚255個，獲得單倍體幼苗174株，成苗率68.24%，以B5為基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)單倍體胚233個，獲得單倍體幼苗149株，成苗率63.95%。

2.2 基礎培養(yǎng)基中不添加激素對小麥單倍體胚成苗率的影響

研究表明，對于春小麥單倍體胚而言，1/2 MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基中不添加激素均能夠使單倍體胚萌發(fā)、生根分化成苗，兩者的成苗率分別為73.49%和72.86%，差異不顯著。相較于B5培養(yǎng)基，1/2 MS培養(yǎng)基上的單倍體胚生根更快，根系數(shù)量3～7條，長度為2～9 cm，幼苗發(fā)育較緩慢，但生長較為健壯，葉片較長(圖1A)，而B5培養(yǎng)基上的單倍體胚萌發(fā)較快，但幼苗生長較弱，葉色較淺，根系生長緩慢，根系數(shù)量1～4條，長度為1～5 cm。雖然兩種基礎培養(yǎng)基上的成苗率并無顯著差異，但是根據(jù)幼苗生長情況來看，1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的幼苗生長健壯，根系發(fā)達，更適宜后期的移栽和加倍處理。表2，圖1

表2 不同培養(yǎng)基胚培養(yǎng)效果
Table 2 Effect of embryos cultured in different mediums

培養(yǎng)基編號Medium No.單倍體胚數(shù)The number of embryos幼苗株數(shù)The number of plantlets根系數(shù)量The number of roots根系最大長度The maximum length of roots (cm)成苗率The percentage of plantlets formation (%)183615.26 7.99 73.49259436.14 8.41 72.88353354.69 7.53 66.04460353.03 6.15 58.33570512.75 4.88 72.86654344.50 6.42 62.96760333.97 6.24 55.00849312.68 4.95 63.27

注：A：春小麥單倍體胚在1號培養(yǎng)基上分化成苗；B：1、2號培養(yǎng)基幼苗生長狀況對比(左：2號培養(yǎng)基，右：1號培養(yǎng)基)；C：7號培養(yǎng)基上幼苗生根情況；D：8號培養(yǎng)基上幼苗生根情況

Note: A: Plantlets production in No. 1 medium; B: Comparison of seedlings status in No. 1 and No. 2 mediums (left: No. 2 medium, right: No. 1 medium); C: roots of plantlets in No. 7 medium; D: roots of plantlets in No. 8 medium

圖1 幼苗在不同培養(yǎng)基上生長
Fig.1 Conditions of plantlets in different mediums

2.3 基礎培養(yǎng)基中添加激素對小麥單倍體胚成苗率的影響

研究表明，與基礎培養(yǎng)基相比，添加激素使小麥單倍體胚成苗率呈現(xiàn)不同程度的下降，除了2號培養(yǎng)基(1/2 MS+0.1mg/L 2,4-D)下降不顯著外，其余培養(yǎng)基成苗率下降均達到顯著水平。2號培養(yǎng)基雖然成苗率較1/2 MS培養(yǎng)基下降了0.61%，但是幼苗葉色較深，葉片較寬，植株短粗，根系粗壯且數(shù)量較多，長度可達到10 cm以上(圖1B)，單倍體胚基本可實現(xiàn)一步成苗，而且幼苗健壯，非常有利于后期的移栽和加倍處理。

添加激素的培養(yǎng)基中，單倍體胚培養(yǎng)3～5 d左右時呈現(xiàn)明顯的膨大，但除2號培養(yǎng)基在5～7 d左右萌發(fā)出幼芽外，其余培養(yǎng)基均需10 d左右才會出現(xiàn)幼芽萌發(fā)，且萌發(fā)后生長遲緩，葉片細長，葉色也較淺，幼苗總體較弱。

試驗設計的8個培養(yǎng)基中幼苗的生長情況表明，2,4-D對于小麥單倍體胚的生根具有明顯的促進作用，在添加2,4-D的4種培養(yǎng)基中，根系發(fā)育較快，根系數(shù)量4～6條，根系最大長度均超過6 cm(圖1C)，而在不添加2,4-D的3種培養(yǎng)基(除去1/2 MS培養(yǎng)基)中，根系數(shù)量僅為3條左右，根系最大長度為5 cm左右(圖1D)。無論是在1/2 MS培養(yǎng)基還是B5培養(yǎng)基中，添加2,4-D對于小麥單倍體胚分化的促進作用較IAA更加明顯，分別對比3、4、7、8號培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加2,4-D單倍體胚成苗率、根系數(shù)量、最大根系長度均優(yōu)于添加IAA的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中添加細胞分裂素6-BA對于小麥單倍體胚的分化并未起到促進作用，單倍體胚的成苗率、根系數(shù)量、最大根系長度均有不同程度的下降。表2，圖1

3 討 論

通過玉米花粉誘導春小麥產生單倍體胚，由于種間不親和造成春小麥胚乳發(fā)育不全或不發(fā)育，因此，單倍體胚的分化更多依賴于外界提供的營養(yǎng)元素和激素，選擇合適的培養(yǎng)基對于單倍體胚的分化具有重要的影響。研究采用了8種不同配方的培養(yǎng)基對春小麥單倍體胚進行離體培養(yǎng)，結果表明，相較于B5培養(yǎng)基，以1/2 MS為基礎培養(yǎng)基更適宜新疆春小麥單倍體胚的分化，尤其是對于單倍體胚的根系分化促進作用明顯，其中加入微量的2,4-D雖然在成苗率方面并無明顯促進作用，但是對于單倍體胚的分化、生根、壯苗均能起到很好的促進作用，單倍體胚成苗率可達72.88%，且幼苗生長健壯，根系發(fā)達，這與趙翠榮[12]、陳新民[5]、陳淑萍[15]、蔡東明[14]、高艷[16]等的研究結果并不完全一致，究其原因，可能是由于春小麥基因型不同所致，也可能與單倍體胚發(fā)育狀態(tài)有關。

細胞分裂素能夠有效的促進細胞分裂并調控其分化，陳淑萍[15]、蔡東明等[14]通過1/2 MS培養(yǎng)基中添加6-BA能夠顯著提高小麥單倍體胚的成苗率，高艷等[16]在1/2 MS培養(yǎng)基中添加KT也明顯提高了單倍體胚的成苗率，然而在試驗中，添加6-BA并未提高春小麥單倍體胚的分化成苗率，反而造成了不同程度的降低，造成這一結果的原因可能與細胞分裂素的種類、使用濃度及其與生長素的使用比例密切相關，仍需對細胞分裂素促進春小麥單倍體胚分化作進一步研究。

陳淑萍[15]、高艷等[16]通過單倍體胚的離體培養(yǎng)均產生了叢生芽，試驗中雖有部分培養(yǎng)基上的單倍體胚形成愈傷組織并產生了叢生芽，但大部分單倍體胚仍然只分化出了一株幼苗。通過單倍體胚分化叢生芽能夠顯著提高獲得單倍體幼苗的數(shù)量，進而促進小麥×玉米遠緣雜交技術在育種實踐中的應用，還需對春小麥單倍體胚分化叢生芽的影響因素進行研究，在離體培養(yǎng)階段提高單倍體植株的獲得效率。

4 結 論

使用玉米花粉誘導春小麥產生單倍體胚，在1/2 MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基中均能夠分化成苗，其中不添加激素的1/2 MS培養(yǎng)基成苗率最高，為73.49%。培養(yǎng)基中添加2,4-D能夠有效促進春小麥單倍體胚的根系發(fā)育，其中1/2 MS +0.1 mg/L 2,4-D培養(yǎng)基上生長15 d的春小麥單倍體幼苗根系平均數(shù)量為6.14條，根系最大長度為8.41 cm，而且單倍體胚萌發(fā)快，幼苗健壯，葉色較深，根系生長迅速，一步成苗，可作為春小麥單倍體胚離體培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

參考文獻(References)

[1] Zenkteler M, Nitzsche W. (1984). Wide hybridization experiments in cereals.Tag.theoretical&AppliedGenetics.theoretischeUndAngewandteGenetik, 68(4): 311-315.

[2] Laurie D A, Bennett M D. (1986). Wheat×maize hybridization[J].CanadianJournalofGeneticsandCytology, 28(2): 313-316.

[3] Laurie D A, Bennett M D. (1988). The production of haploid wheat plants from wheat x maize crosses[J].Theoretical&AppliedGenetics, 76(3): 393-397.

[4] Laurie D A, Reymondie S. (1991). High frequencies of fertilization and haploid seedling production in crosses between commercial hexaploid wheat varieties and maize[J].PlantBreeding, 106(3): 182-189.

[5] 陳新民，徐惠君，周俊芳，等. 提高小麥×玉米胚培養(yǎng)植株產生頻率的研究[J].中國農業(yè)科學， 1996， 29(4): 29-32.

CHEN Xin-ming, XU Hui-jun, ZHOU Jun-fang, et al. (1996). A Study on the increasing frequences of plant production during embryo culture in crosses between wheat and maize [J].ScientiaAgriculturaSinica，29(4): 29-32. (in Chinese)

[6] 閆貴云，左靜靜，馮瑞云，等. 玉米花粉誘導小麥單倍體技術研究進展[J]. 山西農業(yè)科學， 2015，43(9): 1 204-1 206.

YAN Gui-yun, ZUO Jing-jing, FENG Rui-yun, et al. (2015). The research progress of wheat haploid induced by maize pollen [J].JournalofShanxiAgriculturalSciences, 43(9): 1,204-1,206. (in Chinese)

[7] 王重，樊哲儒，張躍強，等. 春小麥單倍體胚得胚率的影響因素分析[J]. 新疆農業(yè)科學, 2016， 53(8): 1 404-1 408.

WANG Zhong, FAN Zhe-ru, ZHANG Yue-qiang, et al. (2016). Analysis of influencing factors on embryo rate of haploid embryos in spring wheat[J].XinjiangAgriculturalSciences, 53(8): 1,404-1,408. (in Chinese)

[8] 孫敬三，劉輝，路鐵剛，等. 利用小麥×玉米獲得小麥單倍體[J]. 植物學報, 1992，34(11): 817-821.

SUN Jing-san, LIU Hui, LU Tie-gang, et al. (1992) The production of haploid wheat plants via wheat×maize hybridization [J].ActaBotanicaSinica，34(11): 817-821. (in Chinese)

[9] 陳新民，王鳳菊，李思敏，等. 小麥與玉米雜交產生小麥單倍體與雙單倍體的穩(wěn)定性[J]. 作物學報, 2013，39(12): 2 247-2 252.

CHEN Xin-ming, WANG Feng-ju, LI Si-min, et al. (2013). S
Table production of wheat haploid and doubled haploid by wheat × maize cross [J].ActaAgronomicaSinica, 39(12): 2,247-2,252. (in Chinese)

[10] Niroula R K, Bimb H P. (2009). Overview of wheat × maize system of crosses for dihaploid induction in wheat[J].WorldAppliedSciencesJournal, 7(8): 1,037-1,045.

[11] Brazauskas G, Pa akinskien I, Ruzgas V. (2005). Improved approaches in wheat × maize crossing for wheat doubled haploid production[J].Biologija, (4): 15-18.

[12] 趙翠榮，楊青，王立峰，等. 培養(yǎng)基和基因型對小麥×玉米誘導單倍體效率的影響[J]. 中國種業(yè), 2014，(9): 33-35.

ZHAO Cui-rong, YANG Qing, WANG Li-feng, et al. (2014). Effects of mediums and genotypes on frequencies of producing haploid of wheat×maize [J].ChinaSeedIndustry, (9): 33-35. (in Chinese)

[13] 張闊，胡洪林，夏艷龍，等. 培養(yǎng)基對小麥×玉米誘導小麥單倍體效率的影響[J]. 現(xiàn)代化農業(yè), 2009，(9): 9-11.

ZHANG Kuo, HU Hong-lin, XIA Yan-long, et al. (2009). Effects of mediums and genotypes on frequencies of producing haploid of wheat×maize [J].ModernizingAgriculture, (9): 9-11. (in Chinese)

[14] 蔡東明，吉萬全，任志龍，等. 小麥單倍體育種中培養(yǎng)基的研究[J]. 中國農學通報, 2007，23(5): 71-74.

CAI Dong-ming, JI Wan-quan, REN Zhi-long, et al. (2007). Studies on culture medium of wheat haploid breeding[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 23(5): 71-74. (in Chinese)

[15] 陳淑萍，王雪征，崔銀輝，等. 不同培養(yǎng)基對小麥×玉米雜種胚離體培養(yǎng)成苗的影響[J]. 核農學報, 2013，27(6): 758-762.

CHEN Shu-ping, WANG Xue-zheng, CUI Yin-hui, et al. (2013). Effect of different culture media on haploid plantlets production from the wheat×maize cross[J].ActaAgriculturaeNucleataeSinica, 27(6): 758-762. (in Chinese)

[16] 高艷，唐建衛(wèi)，殷貴鴻，等. 培養(yǎng)基對小麥單倍體胚成苗率的影響[J]. 中國農學通報, 2015，31(21):107-110.

GAO Yan, TANG Jian-wei, YIN Gui-hong, et al. (2015). Effect of culture media on seedling rate of wheat haploid[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 31(21):107-110. (in Chinese)