利用微透析技術在大鼠腦內取樣的方法

代潔瓊 賈欣 喬巧玉 王志華 趙欣 杜振瑩 關曉雅 張宇

【摘要】 本文通過查詢文獻并結合筆者的實際操作經驗，介紹微透析技術原理，以及利用微透析技術進行清醒大鼠rACC腦區(qū)定位取樣的方法。

【關鍵詞】 微透析； 透析液； 立體定位； rACC腦區(qū)； 大鼠

前扣帶皮層（anterior cingulate cortex，ACC），尤其是其吻側部（rostral ACC，rACC）是參與情緒情感反應的重要中樞[1-3]。已有研究證實，rACC也是傷害性刺激傳入高位中樞時形成痛厭惡情緒的重要腦區(qū)[4-6]，那么在痛情緒發(fā)生時rACC腦區(qū)神經元釋放的神經遞質有何變化是我們所關注的。微透析技術正是一種可以探究這一問題的手段。該技術是將灌流取樣和透析技術結合起來并逐漸完善的一種從生物活體內進行動態(tài)微量生化取樣的新技術，具有活體連續(xù)取樣、動態(tài)觀察、定量分析、采樣量小、組織損傷輕等特點[7]。目前，微透析技術主要應用于大腦、血液、脊髓等部位[8-11]，通過定位后取樣再檢測，觀察目標神經遞質的相對變化，可在麻醉或清醒的生物體上使用。在清醒生物體上進行微透析實驗比起麻醉生物體，取得的樣本會更接近于正常生理狀態(tài)[12]。但由于動物處于可自由活動的狀態(tài)，存在很多不確定因素，因此實驗中所需的條件和對動物的各種操作均要在不斷地摸索和嘗試中確定。筆者通過查詢文獻并結合作者的實驗操作經驗，介紹利用微透析技術進行清醒大鼠rACC腦區(qū)定位取樣的方法，現(xiàn)報道如下。

1 定位

1.1 微透析探針的選取 微透析探針的供應商有瑞典的CMA公司，美國的BAS公司和日本的EICOM公司，另外也有實驗室采用自制的微透析探針。本實驗室采用的是EICOM公司的探針，根據(jù)定位腦區(qū)的深度和所需檢測的目標神經遞質的分子量大?。ㄒ话銠z測的神經遞質為氨基酸類神經遞質和單胺類神經遞質），選擇所需的探針規(guī)格。EICOM公司的腦組織探針主要有三個系列，本實驗室選用的探針樣式為A-Z系列帶有導管、內芯和導管配套的螺帽，探針規(guī)格為管長4 mm，膜長2 mm，膜材料：人造纖維素，50 kDa截留分子量，見圖1。

1.2 埋置導管定位手術 雄性SD大鼠，250～270 g，1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠（40～50 mg/kg）成功后，將其固定于腦立體定位儀上。切開頭皮，清除皮下筋膜，暴露顱骨，以前囟（Bregma）點為0點，根據(jù)Paxinos & Watson圖譜[13]rACC坐標，AP：+2.6 mm，ML：±0.6 mm，DV：-2.8 mm，見圖2。將導管埋置于rACC定位標記點，插入導管對應的內芯，擰上螺帽，后用牙托水泥固定。固定時應注意將頭皮和牙托水泥接縫處分開，有助于膿血的滲出。術后3～5 d即可進行微透析實驗。實驗結束后向取樣部位注入染料，病理切片觀察定位是否準確。

2 基本原理

將帶有透析膜的探針定位于需采樣的生物體組織，用一種非常精密的注射泵進行液體灌流，推送溶液至探針處，以達到與組織內欲取出測量的低分子量物質，進行透析交換。交換后的透析液被采集，通過高效液相或其他儀器做進一步的分析，見圖3。

3 取樣

3.1 取樣前準備 溫度恒定24 ℃，灌流液選用復方氯化鈉溶液，因為其pH值和滲透壓均和腦脊液相似，以此作為人工腦脊液進行灌流，過濾器過濾后，備用。進行取樣前連接好微透析泵、注射器、清醒活動裝置、樣品低溫收集器等裝置。準備1 mL的注射器，充滿三蒸水，固定于微透析泵上，打開微透析泵低速（1 μL/min），使微透析管道內充滿三蒸水，以充分排出管內氣體。

進行探針檢測：用管路接頭和管路連接探針的入口與注射器針頭（長進短出，黃進藍出）；以低速（1 μL/min）向探針注射三蒸水，若整個探針膜表面有濕潤或“流淚”現(xiàn)象出現(xiàn)，則該探針正常，可以使用；若觀察到探針膜某處成股狀流出三蒸水，說明探針膜有破損或漏洞，應更換探針。

3.2 清醒大鼠取樣 取樣裝置和取樣示意圖，如圖4、5所示，在取樣前應先將大鼠放入裝置適應15 min，以減少環(huán)境對動物的新異刺激。開啟透析泵使灌流液充滿整個管路，然后將導管中的內芯取出，裝備插入探針，插入探針前用三蒸水或人工腦脊液多次沖洗導管內，防止導管內有異物堵塞導管，損毀探針。使大鼠處于氣體麻醉狀態(tài)下，迅速插入并固定探針，將大鼠放回裝置待其清醒后，打開恒流注射泵開始灌流透析。用復方氯化鈉以2 μL/min的速度收集樣品，因為插入探針時的刺激、微透析液中混有破碎細胞的細胞內成分等都會對檢測結果造成一定的影響，所以開始取樣后60 min（平衡時間）透析液棄去不用，待目標神經遞質檢測結果達到穩(wěn)定，便可定時收集樣本至-80 ℃保存。若收集的腦脊液用來測單胺類的神經遞質，則需在收集管中加入穩(wěn)定劑（穩(wěn)定劑：收集的腦脊液=1︰4）。穩(wěn)定劑配制方法：若配制100 mL穩(wěn)定劑：0.01 g Na2EDTA，220 μg抗壞血酸，0.6 mL無水乙酸，加水至100 mL。

收集樣本時除了要時刻觀察探針是否脫出外還應注意每管收集液的體積是否大致相同，如出現(xiàn)明顯的差異則說明探針的透析膜出現(xiàn)損害或者微量泵出現(xiàn)偏差，應立刻停止實驗，確定問題出處后重新開始。另取樣速度和平衡時間的選擇要適當，兩者成反比，當速度過快時，平衡時間長，透析液中神經遞質含量過低。當速度過慢時，平衡時間短，但不利于實驗設計。

取樣方法成功的標準為：平衡時間后，每隔10分鐘連續(xù)收集三管透析液，能夠在透析液中檢測出目標神經遞質的含量，并且?guī)状螜z測的數(shù)據(jù)不具有統(tǒng)計學差異，可認為目標神經遞質在平衡60 min后達到穩(wěn)定狀態(tài)[14]。

4 取樣后管路和探針的清潔和保養(yǎng)

探針的清洗和保存：取樣結束后，立即取出探針，放入三蒸水中。將探針與管路連接，用1 μL/min的速度沖洗過夜，充分排出管路和探針中存留的鹽分后，取下探針，放入三蒸水中于4 ℃冰箱保存，用于防止探針透析膜收縮。若透析液體積和灌流液體積不一致，可能是探針被凝固的血液堵塞，可將探針置于胰蛋白液中，待可見物質從探針膜端剝落即取出。

管路在沖洗完畢后，自然晾干，密封出入口，置于低溫條件保存，防止細菌滋生。

5 討論

微透析技術在神經科學、醫(yī)藥研究等領域已獲得越來越廣泛的應用[15-20]?？梢杂糜趯崟r的神經遞質變化的檢測，不同于組織勻漿技術，不需要破壞機體的完整性，可維持在生理狀態(tài)下神經遞質檢測。微透析實驗和其他很多實驗不同，很多方面取決于操作者的技能水平[21]。本文通過筆者的實驗操作經驗，介紹利用微透析技術進行清醒大鼠rACC腦區(qū)定位取樣的技術要領。

在實驗操作時應注意：（1）探針的選擇要根據(jù)所檢測部位的定位深度和神經遞質分子量的大小，選擇所需的規(guī)格；（2）探針埋置定位要準確，可根據(jù)腦圖譜（AP、ML、DV值）要準確，微透析實驗結束后要進行病理切片觀察定位是否準確；（3）在取樣前連接管路后，微注射器充滿三蒸水后，進行灌流觀察管路是否有漏液或堵塞，同時檢測探針透析膜是否完好，是否可以使用；（4）插入探針前用三蒸水或人工腦脊液多次沖洗導管內，防止導管內有異物堵塞導管，損毀探針；（5）插入探針時，確定大鼠處于氣體麻醉狀態(tài)，插入探針時要特別注意不要損壞探針膜，延長探針的使用壽命和次數(shù)；

（6）取樣時要注意平衡時間和取樣速度的確定，單胺類神經遞質要在收集管中加入穩(wěn)定劑；（7）取樣成功的標準為平衡時間后，每隔10分鐘連續(xù)收集三管透析液，能夠在透析液中檢測出目標神經遞質的含量，并且?guī)状螜z測的數(shù)據(jù)不具有統(tǒng)計學差異；（8）取樣后要注意管路和探針的清潔和保養(yǎng)，連接管路和探針，三蒸水低速灌流過夜，排出管路和探針中殘余的鹽分；（9）清潔完畢后，探針置于三蒸水中4 ℃冰箱保存，管路自然晾干，密封開口，低溫保存。

本文總結了筆者在進行微透析實驗時，定位和取樣以及取樣后探針的清潔與保存的操作方法，為類似的腦區(qū)定位微透析取樣實驗提供方法依據(jù)。

參考文獻

[1]王媛.前扣帶皮層神經元NMDA受體在痛情緒形成中的作用觀察[D].太原：山西醫(yī)科大學，2016.

[2] Issue R.Local Heroes vs Central Government in Tajik East[J].Pain，2012，146（1-2）：183-193.

[3]張肖怡.激活前扣帶皮層神經元μ阿片受體可緩解大鼠的痛情緒反應[D].太原：山西醫(yī)科大學，2014.

[4]韓梅.大鼠前扣帶皮層SIP30參與痛厭惡情緒反應的細胞分子機制[D].天津：復旦大學，2011.

[5] Kim E，Kyeong S，Cheon K A，et al.Neural responses to affective and cognitive theory of mind in children and adolescents with autism spectrum disorder[J].Neurosci Lett，2016，621（72）：117-125.

[6]唐雨龍，張玉秋.前扣帶皮層NMDA受體-MAPK-CREB通路參與痛厭惡情緒的分子機制[J].生理學報，2017，69（5）：637-646.

[7]韓慧婉，舒鴻鈞，劉國詮.微透析技術及其應用[J].化學通報，2000，63（12）：52-56.

[8]楊盟，楊帝順，唐曉萌，等.基于皮膚、血液雙位點同步微透析技術的雷公藤甲素納米乳體內藥動學研究[J].中國藥學雜志，2018，53（11）：894-899.

[9]劉奇，杜萍，施曉蘭，等.腦微透析探針置入對大鼠海馬葡萄糖、乳酸水平的影響[J].成都中醫(yī)藥大學學報，2018，41（2）：8-10.

[10]呂揚，張雅文，譚磊，等.脊髓損傷模型中胞外抗壞血酸濃度的活體在線分析[J].分析化學，2017，45（11）：1595-1599.

[11]陳騰飛，劉建勛，宋文婷，等.人參皂苷Rg1腦、血微透析探針體內外回收率研究[J].中國藥學雜志，2018，53（06）：434-438.

[12]樊官偉，高秀梅.微透析技術及其應用進展[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17（9）：1781-1782.

[13] Hargreaves K，Dubner R，Brown F，et al.A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia[J].Pain，1988，32（1）：77-88.

[14] Kealy J，Bennett R，Woods B，et al.Real-time changes in hippocampal energy demands during a spatial working memory task[J].Behavioural Brain Research，2017，326（5）：59-68.

[15]劉健，吳嘉敏，方平飛.微透析技術在腫瘤藥物研究中的應用進展[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2018，38（7）：792-795.

[16]楊邦坤，陳謙學.腦微透析技術在神經科學中的應用進展[J].中華實驗外科雜志，2017，34（8）：1430-1432.

[17] Crick E W，Osorio I，F(xiàn)rei M，et al.Correlation of 3-Mercaptopropionic Acid Induced Seizures and Changes in Striatal Neurotransmitters Monitored by Microdialysis[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences，2014，57（1）：25-33.

[18]李朝暉，魏君.腦微透析監(jiān)測在動脈瘤性蛛網膜下腔出血中的應用進展[J].國際神經病學神經外科學雜志，2018，45（1）：87-90.

[19]李玉潔，龔曼，魏丹丹，等.微透析技術在中藥歸經理論研究中的應用[J].社區(qū)醫(yī)學雜志，2018，16（1）：80-82.

[20]管詠梅，肖芳，金晨，等.微透析技術在中藥外用制劑中的應用[J].中國新藥雜志，2017，26（5）：530-534.

[21]萬海嬌，楊麗萍，李新民，等.微透析取樣技術及其在腦內研究中的應用進展[C].中華中醫(yī)藥學會中醫(yī)基礎理論分會第九次學術年會，2015.

（收稿日期：2018-05-07） （本文編輯：程旭然）