植原體病害及其相關(guān)植物激素研究進(jìn)展

劉俊男，王柱華，趙　宇，蔡　紅*，郭喬優(yōu)

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省植物病理重點實驗室，昆明 650201；2.云南省建水植保植檢站，云南 建水 654300）

植原體(phytoplasma)，原稱類菌原體(mycoplasma-like organism,簡稱MLO)，是一類無細(xì)胞壁、迄今不能人工培養(yǎng)的植物病原細(xì)菌[1]。植原體在世界范圍內(nèi)對許多經(jīng)濟(jì)作物造成減產(chǎn)，例如油菜、小麥、椰子、棗樹等[2]。植原體的主要傳播方式是通過葉蟬、飛虱等具有刺吸式口器的昆蟲取食植株韌皮部汁液進(jìn)行傳播[3]，其他還可通過嫁接、菟絲子傳播。Neimark等[4]采用脈沖場電泳分析方法，從寄主植物中首次分離出完整的植原體，發(fā)現(xiàn)植原體的染色體呈環(huán)形，之后的研究發(fā)現(xiàn)也有線形染色體存在[5]，大小在640～1 185 kb之間。隨后，Marcone等[6]全面對植原體大小進(jìn)行了準(zhǔn)確測定，發(fā)現(xiàn)最小的染色體為530 kb，并且有的樣品不只存在一條植原體染色體。植原體染色體的G+C含量偏低，在24%～35%之間[5]。

植原體侵染造成寄主植物表現(xiàn)叢枝（莖、枝和葉增殖）、花變綠（沒有綠色組織的花變成綠色）、花變?nèi)~（花器官返祖轉(zhuǎn)變成葉）、小葉、矮化、黃化、節(jié)間縮短等癥狀[7]。植原體侵染造成寄主植物表現(xiàn)各類癥狀與激素之間關(guān)系的研究尚不全面，目前對生長素的研究較多。

植原體存在于寄主植物韌皮部篩管細(xì)胞中[8]。植物生理學(xué)證明,韌皮部是營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)耐ǖ?，植株各部位的韌皮部中營養(yǎng)成份及其含量存在差異，而植原體對營養(yǎng)物質(zhì)、滲透壓、pH等條件的要求非?？量?，植原體會隨著營養(yǎng)物質(zhì)在韌皮部中的運輸而移動，因此，可以很好地理解植原體在病株體內(nèi)分布不均[9]。此外，植原體的存在可能受到溫度的影響。劉秉勝等[10]在實驗中發(fā)現(xiàn)在桑樹生長初期各部位的植原體含量都很低，隨著寄主植物的生長，植原體含量增加，癥狀表現(xiàn)也更加明顯，在夏季7、8月份的高溫季節(jié)達(dá)到頂端。而在寒冷的季節(jié)，只能在桑樹病株的根部檢測到植原體，而莖部檢測不到。

1　激素研究現(xiàn)狀

植物內(nèi)源激素是由植物自身代謝產(chǎn)生并運輸?shù)礁鞑课?，這些含量極其微少但能產(chǎn)生明顯生理效應(yīng)的物質(zhì)對植物的休眠萌發(fā)、生長衰老、開花結(jié)果、細(xì)胞的分裂分化以及植物的組織培養(yǎng)起著極其重要的作用[11]。植株感染植原體后表現(xiàn)癥狀往往是多種激素的協(xié)同作用，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

由于植物激素對植物的生長、發(fā)育、成熟、衰老等生理過程起著重要的作用，所以激素含量的檢測是研究植物與病原互作過程中生理變化的重要方法[12]。內(nèi)源激素在植株體內(nèi)含量極低且性質(zhì)不穩(wěn)定，易受細(xì)胞中其他物質(zhì)的干擾，因此需要靈敏、有效的方法檢測激素含量[12]。傳統(tǒng)的生物鑒定法由于專一性差、靈敏度低、時間長、重復(fù)性低等缺點已較少運用；RIA（放射免疫法）和ELISA（酶聯(lián)免疫法）也由于重復(fù)性差、準(zhǔn)確性低等原因較少使用；目前國內(nèi)外將HPLC（高效液相色譜法）廣泛地運用于激素（除乙烯外的植物內(nèi)源激素）的定性定量測定。HPLC是一種高效純化分離技術(shù)，具有高靈敏度和準(zhǔn)確性[11]。

由于植原體只能寄生在寄主植物或是介體昆蟲體內(nèi)[13]，因此給植原體的生理機(jī)制、代謝水平、致病機(jī)理等水平的研究帶來很大困難。國內(nèi)目前對于感染植原體植株內(nèi)源激素的研究還不全面，且激素的研究主要集中在對激素含量的測定，還需要更進(jìn)一步研究以明確植原體與激素的互作關(guān)系以及致病機(jī)理。從植物內(nèi)源激素等生理生化的角度出發(fā)有助于植原體的進(jìn)一步研究。

1.1　萎縮癥狀與激素的關(guān)系

植株受到植原體的侵染，導(dǎo)致內(nèi)源激素分泌發(fā)生紊亂，同時表現(xiàn)出不同的癥狀。多年來，人們對感病植株的激素進(jìn)行研究，探討激素變化與植原體以及癥狀表達(dá)之間的關(guān)系。

劉秉勝等[10]利用酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）對桑樹萎縮病進(jìn)行了研究。應(yīng)用PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）監(jiān)測植株體內(nèi)植原體的周年分布規(guī)律并與寄主激素水平進(jìn)行探討。發(fā)現(xiàn)病株生長素（IAA）、細(xì)胞分裂素（玉米素+玉米核苷，二氫玉米素+二氫玉米素核苷）及赤霉素（GA3，GA4）的含量都明顯高于健株。雖然利用普通PCR檢測植原體含量并不準(zhǔn)確，但是初步探討了植原體在病株體內(nèi)含量的周年變化存在一定的規(guī)律性，并且與桑樹萎縮病狀的周期相吻合。推斷出桑樹表現(xiàn)出萎縮癥狀是由于生長素含量過高，抑制了根的生長，使根吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力減弱，導(dǎo)致地上部分營養(yǎng)不足，產(chǎn)生小葉、黃化、節(jié)間縮短等萎縮癥狀。通過進(jìn)一步組培實驗表明，赤霉素含量的升高在患病桑樹中并沒有表現(xiàn)出應(yīng)有的生理效應(yīng)，根據(jù)赤霉素與生長素之間的相互聯(lián)系，推測赤霉素在病狀形成過程中的作用可能是通過促進(jìn)生長素含量升高實現(xiàn)的。

1.2　叢枝癥狀與激素的關(guān)系

棗瘋病[14]是一種毀滅性的病害，感病植株典型癥狀是小葉、叢枝、矮化、花變異、枯死。目前國內(nèi)對于棗瘋病激素的研究比較多，但主要集中在叢枝癥狀與激素的關(guān)系方面。國內(nèi)外提出的普遍觀點是C/A（分裂素/生長素）比例失調(diào)引起的。何放亭等[15]對甘薯叢枝病內(nèi)源激素的C/A值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與健株相比，病株的分裂素（玉米素，Zeatin）一直處于較高水平，生長素只在塊莖萌發(fā)時含量增高，其余時期無明顯差異，而病株的C/A值恒高于健株。趙錦等[16]用HPLC法分別對健株、病株和治療轉(zhuǎn)健的棗樹中的生長素（吲哚乙酸，IAA）、細(xì)胞分裂素（玉米素，Zeatin）、赤霉素（GA3）和脫落酸（ABA）進(jìn)行亞周年檢測，通過數(shù)據(jù)分析得知IAA，GA3和ABA不管在根部還是葉片中含量一直沒有顯著變化，而細(xì)胞分裂素則呈上升趨勢。通過不同患病程度的激素比較，發(fā)現(xiàn)患病程度越重，Zeatin/IAA（C/A）比值越高，說明植株受到植原體的侵染后，內(nèi)源激素失衡，細(xì)胞分裂素相對含量升高，從而造成棗瘋病的叢枝癥狀。2013年，杜紹華等[17]用組培苗研究植原體侵染對棗樹激素含量的影響，感病植株內(nèi)源生長素（IAA）含量低于健康植株，內(nèi)源玉米素（ZT）、赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）含量有所提高，且與發(fā)病呈正相關(guān)。同時得出抗病品種較感病品種健康植株內(nèi)源游離生長素、脫落酸含量水平高，玉米素、赤霉素含量水平低。結(jié)果表明植原體與棗樹互作的過程中，吲哚乙酸氧化酶活性降低，導(dǎo)致IAA水平明顯低于健株，從而導(dǎo)致植物節(jié)間縮短，頂端優(yōu)勢喪失，大量萌發(fā)側(cè)芽，生根能力也降低，同時脫落酸的積累促進(jìn)植株表現(xiàn)出黃化、小葉、矮化等癥狀，分裂素水平升高導(dǎo)致大量腋芽萌生。泡桐叢枝病造成嚴(yán)重的林木病害，每年給我國的林業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。對泡桐叢枝病的研究表明，該病是受逆境損傷后導(dǎo)致酶系統(tǒng)變化和內(nèi)源調(diào)節(jié)物質(zhì)——激素比例失衡引起器官、組織等異常分化[18]。

1.3　巨芽癥與激素的關(guān)系

赤霉素是一類重要的植物激素，調(diào)節(jié)種子萌發(fā)，莖伸長和花的形成[19]。番茄植株感染土豆紫頂植原體（potato purple top,PPT）后產(chǎn)生巨芽癥，植株體內(nèi)赤霉素含量顯著減少。巨芽癥是一種異常的花狀結(jié)構(gòu)，萼片擴(kuò)大、融合，雌蕊、雄蕊、花瓣發(fā)育不全[20]。Ding等[21]通過實驗發(fā)現(xiàn)赤霉素含量減少是由于GA代謝相關(guān)基因下調(diào)和植原體感染后激發(fā)GA生物合成反饋調(diào)節(jié)的敏感性降低。但植原體是如何引起GA負(fù)反饋調(diào)節(jié)的敏感性降低還尚不清楚。

2　植原體病害防治進(jìn)展

多年來，對植原體病害的防治進(jìn)行了許多嘗試，包括抗生素治療、抗性品種研究、組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合熱療的脫毒培養(yǎng)等，而其中又主要集中于抗生素活性的研究。

四環(huán)素對植原體有抑菌作用[22-23]，但是將處理后的植株轉(zhuǎn)移到無抗生素的培養(yǎng)基上癥狀又會出現(xiàn)。Bradel[24]和Singh[25]報導(dǎo)了四環(huán)素對一品紅（Euphorbia pulcherrima）和長春花（Catharanthus roseus）的殺菌效果。用四環(huán)素處理感病一品紅，幾周后植株體內(nèi)檢測不到植原體，但經(jīng)過長時間的生長且無抗生素處理后，大多數(shù)植株中再次出現(xiàn)植原體[24]。用土霉素處理含有植原體的長春花莖尖外植體，兩周后轉(zhuǎn)移到不含抗生素的培養(yǎng)基上并進(jìn)行6次連續(xù)的轉(zhuǎn)移，選取新生的無癥狀莖進(jìn)行繼代培養(yǎng)，經(jīng)PCR檢測，50%的植株中檢測不到植原體，并保持健康3年以上[25]。杜強(qiáng)等[26]通過組培對棗瘋病治療的康復(fù)藥劑進(jìn)行了篩選研究，結(jié)果表明，在3種抗生素藥物處理中，以大環(huán)內(nèi)酯類藥物羅紅霉素防治效果最好，雖然四環(huán)素、阿奇霉素都表現(xiàn)了能夠完全治愈棗瘋病的效果，但羅紅霉素具有治療速度快，且治愈率高的優(yōu)點。此外，科學(xué)家們還研究了其他物質(zhì)對植原體的殺菌效果，β-氨基-丁酸（β-amino-butyric acid，BABA）[27]對感染了植原體的長春花無效。用多胺[28]包括腐胺、亞精胺或精胺處理，超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了一些變化，比如細(xì)胞的變形和凝結(jié)，說明多胺處理造成植原體的繁殖和運動減緩。此外，還有嘗試采用加熱、熱水處理或結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)來消除不同寄主植物中的植原體。Wang和Hiruki等[29]通過加熱處理已感染了植原體的泡桐苗，從而培養(yǎng)出不含植原體的分生組織。Dai等[30]利用莖培養(yǎng)來消除桑樹中的植原體。Bianco和Tassart-Subirats(2003)等使用熱水處理消除來自葡萄接穗上的植原體。Parmessur等[31]利用組織培養(yǎng)技術(shù)成功地誘導(dǎo)出沒有甘蔗黃化植原體的愈傷組織。Chalak等[32]成功地運用組織莖切割培養(yǎng)結(jié)合熱療技術(shù)從兩個杏仁品種中誘導(dǎo)出沒有植原體的芽。

3　激素與病害防治

對于植原體的治療，補(bǔ)充外源生長素的嘗試也很多。馮志敏等[18]利用植物激素（NAA、IBA和ABA）處理感病的泡桐樹，發(fā)現(xiàn)外源激素對泡桐的生長形態(tài)有改變，對癥狀有緩解作用，且NAA比相同濃度的IBA更有利于感病植株的生長，繼代培養(yǎng)數(shù)越多，效果也更加明顯。M.C′urkovic′Perica等[33]用IAA和IBA處理感染不同候選種植原體（CandidatusPhytoplasma）的長春花花芽，發(fā)現(xiàn)這兩種生長素都能使長春花癥狀恢復(fù)，且IBA處理的效果更好。

然而通過激素治療的感病植株在癥狀恢復(fù)后體內(nèi)仍然可能存在植原體。在一些重要的經(jīng)濟(jì)物種（蘋果、葡萄、杏）中，植株的恢復(fù)并不意味著寄主體內(nèi)沒有植原體存在[34]。在蘋果樹中，癥狀恢復(fù)后在樹冠中未檢測到植原體，但在根部仍然可以檢測到[35]；恢復(fù)的葡萄樹葉片中沒有檢測到CandidatusPhytoplasma vitis，但是在恢復(fù)癥狀的杏樹葉中仍然檢測到了Ca.P.prunorum的存在[36]。感病長春花中，Ca.P.pruni和Ca.P.asteris對于生長素治療很敏感，治療后有的通過巢氏PCR檢測不到，而有的則可在第2次的巢式PCR檢測到。但是感染Ca.P.solani和Ca.P.ulmi植原體的長春花癥狀消除后還能檢測到植原體的存在，且通過直接PCR就能檢測到。C′urkovic′Perica 等[37]報道了利用體外培養(yǎng)實驗，用IBA（indole-3-butyric acid）誘導(dǎo)感病長春花芽的恢復(fù)。通過培養(yǎng)感染3種植原體候選種植物的芽揭示了外源生長調(diào)節(jié)劑的改變可造成感病植株癥狀消退，從而更好地生長和進(jìn)行光合作用。實驗中獲得了沒有CandidatusPhytoplasma asteris的長春花。即使感病癥狀已經(jīng)恢復(fù)，仍可通過直接PCR檢測到Ca.P.ulmi(phytoplasma strain EY-C)和Ca.P.solani(phytoplasma strain SA-I)。后期經(jīng)過長期的IBA治療，也不能誘導(dǎo)消除寄主植物中的植原體[38]。相反，感染了Ca.P.pruni(phytoplasma strain KVI)植原體的芽在初步實驗期間沒有表現(xiàn)出任何植原體癥狀緩解，說明外源激素誘導(dǎo)時間和激素濃度主要取決于植原體候選種CandidatusPhytoplasma的種類和激素類型，植原體的敏感程度存在差異。

以上這些寄主植物植原體恢復(fù)的因素至今還不清楚。但是，這些誘導(dǎo)恢復(fù)的有效性取決于根，也就是說即使感病植株經(jīng)過誘導(dǎo)處理后，表型恢復(fù)健康，但是否還有植原體存在，最終要檢測根中有無植原體。而且，恢復(fù)后的植物再次感染植原體的程度比沒有感染過的植株小，M.C′urkovic′Perica等[33]培養(yǎng)感染Ca.P.pruni植原體的長春花并用IBA進(jìn)行處理，將恢復(fù)后的植株繼代培養(yǎng)3代以后轉(zhuǎn)移到含BA的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，有80%的植株檢測不到植原體。表明這是一種系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）可能參與植物的誘導(dǎo)恢復(fù)。

健康植株有效生根需要不同水平的植物生長調(diào)節(jié)劑，而感病長春花截然相反，因此假設(shè)感病長春花中的植原體可能阻止植物激素的運輸并影響外源激素水平[39]。感病植株中內(nèi)源IAA濃度升高，用高濃度的外源生長素處理后的長春花，觀察到細(xì)胞切片中植原體細(xì)胞數(shù)目減少了[40]。這些實驗中都沒有解釋高濃度的外源生長素影響植株的機(jī)制，只是揭示了某種相互依賴關(guān)系。

目前生長素對于IAA的研究數(shù)據(jù)很豐富，但是對于IBA的研究還不太充分。IBA作為一種天然的生長素可能直接或轉(zhuǎn)化為IAA起作用，但比IAA更有效。感染不同植原體的長春花對于IBA處理的反應(yīng)也不相同。

Pertot等[40]已經(jīng)研究過外源生長素對Ca.P.trifolii和感病長春花的影響，報道了感病植株中IAA含量升高，他們假設(shè)生長素的增加是寄主植物面對植原體的侵染時產(chǎn)生的一種直接抵御機(jī)制。另外，他們還測試了外源IAA，IBA，NAA（a-naphthaleneaceticacid）或2,4D（2,4-dichlorophenoxyacetic acid）對感病植原體的影響。雖然這種處理并沒有造成植原體超微結(jié)構(gòu)的改變，但是使植原體在透射電鏡下難以檢測到，說明處理可造成感病芽中植原體細(xì)胞數(shù)目的減少。在沒有處理過或用2,3,5-三碘苯甲酸（生長素遷移抑制劑，TIBA）處理過的感病植株的細(xì)胞中，植原體菌體數(shù)量非常多，但是用生長素處理過的感病植株中，卻難以檢測到植原體。同樣說明生長素能妨礙以Ca.P.為寄主的植株中植原體的存在這一觀點。

M.C′urkovic′Perica 等[33]揭示了生長素誘導(dǎo)感染不同Ca.Phytoplasma的長春花芽的恢復(fù)，而且以相同的方式處理受生長素影響的候選種，意味著植原體對于IAA和IBA消除和生存的機(jī)制是共同的。植原體與寄主的致病相互作用過程中，外源的生長素的補(bǔ)充可能更多地影響內(nèi)源激素的分布水平，觸發(fā)基因表達(dá)的差異調(diào)節(jié)，導(dǎo)致代謝變化不利于植原體Ca.P.asteris和Ca.P.pruni的生長。測序發(fā)現(xiàn)兩個植原體Ca.Phytoplasma缺乏許多代謝基因[41]，并且缺乏的代謝基因不同[42]。Jagoueix-Eveillard等[43]揭示了不同的Ca.P.解除寄主植物基因的表達(dá)不同。因此，不同的Ca.P.對生長素處理的反應(yīng)不同。長春花產(chǎn)生的一種或多種生物堿對Ca.Phytoplasma有抑菌劑的作用。長春花合成大量的生物堿，它們的生物合成和代謝途徑受到不同的激素調(diào)節(jié)(Rischer等，2006)。感染植原體植物的葉片中游離腐胺和結(jié)合多胺的水平上升。此外，多胺的外源性供應(yīng)引起植原體超微結(jié)構(gòu)的各種改變，例如細(xì)胞的變形和凝集，這可能導(dǎo)致該病原體的增殖和移動減少，并且與未受感染的對照相比，多胺處理的枝條中癥狀推遲發(fā)展[28]。

泡桐感染植原體后IAA含量下降與寄主體內(nèi)過氧化物酶活性和IAA氧化酶活性增強(qiáng)有關(guān)，并且植原體存在的韌皮部與IAA氧化酶活性增強(qiáng)部位有關(guān)[44]。有些寄主植物感染植原體后，IAA水平會隨著植物的生長而增高[10]，而有些寄主植物感染植原體后IAA水平不變。田國忠等[44]認(rèn)為仍有可能存在IAA的降解作用并推測病原與寄主相互作用引起IAA水平升高可能是寄主抗性的一種表現(xiàn)，而IAA水平降低則是一種致病的表現(xiàn)。

4　總結(jié)

植原體病害由于不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，因而給植原體病害致病機(jī)制的研究帶來了一定的困難。通過目前從植物內(nèi)源激素方面的研究，發(fā)現(xiàn)：（1）感染植原體病害的植株可以采用施加外源激素來緩解癥狀，但是一旦停止，癥狀又會恢復(fù)，表明植株里面仍然存在植原體，只是沒有表現(xiàn)出癥狀，也說明激素與植原體之間并不是直接作用；（2）植原體不同候選種之間對激素的敏感性存在差異。某些植原體通過短時間的激素治療，感病植株癥狀便可以消除，而有些植原體的治療時間長達(dá)多年；（3）生長素之間也存在差異，不同的生長素治療同一種寄主植物中的同一種植原體候選種，達(dá)到相同的效果需要的濃度不同；（4）激素治療的有效性取決于根，治療成功與否要通過檢測根中是否存在植原體判斷；（5）植原體在受到激素誘導(dǎo)后，細(xì)胞分子的超微結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，比如細(xì)胞的凝集或變形，導(dǎo)致植原體的活動受到影響。

對于植原體與激素的研究還需要更多的實驗及數(shù)據(jù)支持：（1）花變?nèi)~是植原體的另一個典型癥狀，是花器官的返祖現(xiàn)象，然而植株受到植原體侵染后，產(chǎn)生這種癥狀主要是由于哪一種或幾種激素造成的，目前尚不明確。（2）目前對4種內(nèi)源激素（生長素、分裂素、赤霉素和脫落酸）的研究主要集中在對生長素的研究，而植株的生長、發(fā)育、分化往往是多種激素協(xié)同作用，研究其他激素對植原體癥狀的影響，將多種激素結(jié)合起來，可能會提高激素治療的有效性，縮短激素治療時間。（3）植原體與激素的互作機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，明確各種激素的具體影響，以對植原體病害的激素防治做出指導(dǎo)。