一株木霉菌的鑒定及其重金屬-抗生素的復(fù)合抗性

林錦美，陳錦芳，段金明，張金麗，陳文熙

(1.集美大學(xué)港口與海岸工程學(xué)院， 福建 廈門 361021；2.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

抗生素保障了人類及動(dòng)物健康，促進(jìn)了畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展?？股卦缙趯χ虏∥⑸锞哂辛己玫囊种谱饔茫沟闷湓谌粘Ｉ钪械氖褂迷絹碓筋l繁甚至濫用,因此，大量的攜帶有抗生素的代謝物和廢棄物進(jìn)入自然環(huán)境中，加劇了環(huán)境中微生物的抗性壓力。已有的研究報(bào)道[1]，抗性基因很大程度上是由抗生素誘導(dǎo)而產(chǎn)生，該狀況加速了大量抗性微生物的出現(xiàn)，因此，抗生素耐藥性對全球人類健康構(gòu)成威脅。隨著工業(yè)的發(fā)展，重金屬暴露在環(huán)境中的數(shù)量也越來越多，并和抗生素發(fā)生各種復(fù)合作用，通過協(xié)同、交叉等機(jī)制加劇了抗生素抗性基因的污染。研究表明[2-4]，sul1、tetM、tetQ、ermB、mefA等基因與環(huán)境中Cr6+、Cd2+等重金屬濃度也有著顯著關(guān)聯(lián)作用。

霉菌作為一類廣泛存在于土壤、腐爛植物體表面以及重金屬污染度較高的多種生態(tài)環(huán)境中的真核微生物，對植物病原真菌具有拮抗和重寄生作用[5-6]，產(chǎn)生對抗生素、重金屬離子等環(huán)境響應(yīng)的酶如纖維素酶等[7-8]，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[9]。

本文從復(fù)合污染的環(huán)境中篩選獲得抗性霉菌，以抗生素-重金屬復(fù)合抗性菌為研究對象，進(jìn)行了抗性菌的鑒定及其抗性研究。將頭孢拉腚、鹽酸黃連素等抗生素和Cr6+、Cd2+、Cu2+等重金屬進(jìn)行組合以獲得不同培養(yǎng)條件，分析菌體對復(fù)合污染環(huán)境的響應(yīng)，以菌體濃度、蛋白質(zhì)含量、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量為指標(biāo)，方差分析獲得重金屬、抗生素污染與抗性菌生長之間的相關(guān)性，進(jìn)一步探究木霉菌的抗性變化及其機(jī)理，為重金屬與抗生素復(fù)合污染環(huán)境下微生物的抗性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 菌種和培養(yǎng)基 菌株LJM-001分離于腐爛植物根部，并通過ITS分子鑒定保存于-80 ℃?zhèn)溆谩DA培養(yǎng)基制備：分別將馬鈴薯200 g、葡萄糖25 g、瓊脂20 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂2 g溶于1 000 mL無菌蒸餾水中，滅菌(121 ℃，20 min)后冷卻倒置保藏備用。

1.1.2 模擬廢水配制 抗生素溶液的配制：鹽酸黃連素、頭孢拉腚儲(chǔ)備液使用滅菌的超純水配制，采用0.45 μm微孔濾膜將儲(chǔ)備液過濾，避光保存于冰箱，保存時(shí)間不超過一周。模擬重金屬(Cr6+、Cu2+和Cd2+標(biāo)準(zhǔn)液)廢水：分別稱取K2Cr2O7固體1.413 g、CuSO4·5H2O固體3.906 g、CdSO4·7H2O固體2.291 g，分別溶于1 000 mL無菌蒸餾水中，配制好模擬廢水污染液，保存于棕色試劑。

1.1.3 儀器和試劑 顯微鏡(OLYMPUS生物顯微鏡)；PCR儀9700(美國ABI公司)；測序儀3730(美國ABI)；電泳儀DYCP-31DN(北京六一儀器廠)；紫外可見分光光度計(jì)(UV751 GD)；搖床(ZHWY-2112B)；智能生化培養(yǎng)箱(PHX)；臺(tái)式高速離心機(jī)(H1650)；XPS能譜儀(PHI Quantum 2000)。酵母基因組提取試劑盒(Rapid Yeast Genomic DNA Isolation Kit)；DNA聚合酶；真菌通用引物ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；低粘度樹脂包埋試劑盒(Spurr Embedding Kit)；考馬斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)試劑盒；dNTPs；CuSO4·5H2O；HNO3；NaOH試劑；谷胱甘肽，可溶性淀粉，均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 優(yōu)勢霉菌的分離純化 參照程麗云等[10]的方法，從腐爛植物根部經(jīng)選擇性培養(yǎng)基分離得到生長良好的霉菌，通過平板劃線分離以獲得單菌落，并通過斜面試管保藏法保存。

1.2.2 木霉菌特征和形態(tài)鑒定分析 將菌株LJM-001接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基，24 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)72 h，觀察菌絲生長初期，使用插片法觀察并記錄菌落特征。通過光學(xué)顯微鏡觀察菌株分枝狀況和形態(tài)特征以對菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 霉菌總DNA的提取 參照酵母基因組提取試劑盒(Rapid Yeast Genomic DNA Isolation Kit)說明書進(jìn)行DNA提取。

1.2.4 PCR擴(kuò)增ITS區(qū) 以菌株基因組為擴(kuò)增模板，使用50 μL體系，依次加入雙蒸水、緩沖液、dNTP 38，5，2 μL，再加入ITS引物4 μL、DNA聚合酶1 μL、純化后的霉菌DNA 2 μL，經(jīng)過變形、退火、延伸等步驟擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的測序 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger一代測序(上海生工生物工程有限公司)。將測得的序列通過DNAstar(v6.13)將雙端序列融合成一條完整序列，然后將DNA序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫以獲得菌株詳細(xì)分類信息，并下載同源菌株序列，利用軟件MEGA5.03和Figtree進(jìn)行比對分析，構(gòu)建物種進(jìn)化系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 復(fù)合污染實(shí)驗(yàn)過程 根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]的研究結(jié)果，重金屬和抗生素對微生物復(fù)合污染實(shí)驗(yàn)選取的濃度如下：抗生素鹽酸黃連素、頭孢拉腚的質(zhì)量濃度設(shè)為0，5，25，50，100，200 mg/L。將制備好的重金屬Cr6+、Cd2+和Cu2+標(biāo)準(zhǔn)液濃度分別稀釋為0，5，10，50，100，200 mg/L 6個(gè)濃度梯度。通過兩兩組合按照濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并接種培養(yǎng)相同時(shí)間，然后分別測定不同抗生素濃度和不同重金屬濃度組合中菌種的干重、GSH含量以及蛋白質(zhì)含量等，從而表征抗生素與重金屬復(fù)合污染對霉菌生長情況的影響以及霉菌在生長過程中對復(fù)合污染的響應(yīng)機(jī)制。

1.2.7 GSH提取及測定 通過熱水抽提法測定GSH的含量，將1 g干菌粉溶于4 mL蒸餾水后并加入5 mL沸水，充分溶解后95 ℃水浴10 min，及時(shí)取出并進(jìn)行冷卻處理，5 000 r/min 10 min離心處理，通過碘量法[13]測定提取溶液中GSH含量。

1.2.8 蛋白質(zhì)提取及測定 破碎菌體并離心(4 000 r/min，15 min)，取上清液加入硫酸銨，4 ℃鹽析并離心，收集蛋白質(zhì)沉淀。然后利用磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)溶解，并過濾。最后將過濾后的蛋白質(zhì)復(fù)溶于緩沖液中。考馬斯亮藍(lán)法測定組織中的蛋白質(zhì)含量并記錄。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液為0.563 g/L，取0.05 mL稀釋成50倍的待測酶樣、0.05 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、0.05 mL純水，分別加入3 mL考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，混勻顯色10 min后在波長為595 nm處測定其吸光度值，用純水做空白對照。每個(gè)體系重復(fù)3次作為平行實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算酶液中可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理 采用Origin 8.0軟件對Cr6+、Cu2+、Cd2+和抗生素共同作用下霉菌質(zhì)量、GSH含量以及蛋白質(zhì)含量進(jìn)行可視化處理。通過軟件SPSS 22.0分析抗生素種類、重金屬種類、濃度與霉菌重量、GSH含量、蛋白質(zhì)含量之間的相關(guān)關(guān)系，同時(shí)進(jìn)行單變量多因素方差分析，顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬-抗生素復(fù)合抗性菌的篩選及鑒定

2.1.1 菌落的形態(tài)特征 霉菌24 ℃培養(yǎng)3 d，菌落可生長覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿。在平板上，菌落初期呈白色，后期出現(xiàn)輪狀的菌絲密實(shí)產(chǎn)孢區(qū)，顏色為綠色至深綠色，產(chǎn)孢區(qū)最終覆蓋整個(gè)平板。

2.1.2 菌體特征結(jié)構(gòu) 顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，霉菌分生孢子梗呈環(huán)狀排列(見圖1)。其中分生孢子主干生長呈樹狀分布，并呈多向產(chǎn)生二級(jí)孢子分枝，孢子芽部向周邊延伸，呈現(xiàn)以2～3個(gè)分支為一組的形狀，形成以根部收縮而中間膨大的趨勢，分生孢子則呈球形或倒卵圓形。

2.1.3 基于ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 通過NCBI比對獲得物種詳細(xì)信息，并下載近緣物種序列通過ClastalW進(jìn)行比對分析，然后將比對序列結(jié)果利用軟件Figtree構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，該菌株與Trichodermakoningiopsis相似系數(shù)為99%。由圖2可見，該菌株與T.koningiopsis親緣關(guān)系相近，同為里氏木霉屬(Trichoderma)。

2.2 抗生素對菌體重金屬抗性的影響及其相關(guān)性

2.2.1 抗生素對菌體重金屬抗性的影響 在頭孢拉定、鹽酸黃連素質(zhì)量濃度50 mg/L下，菌體對質(zhì)量濃度分別為0，5，10，50，100，200 mg/L的重金屬Cr6+、Cu2+和Cd2+產(chǎn)生的抗性結(jié)果見圖3、圖4。

不同濃度重金屬與頭孢拉定復(fù)合脅迫抗性結(jié)果見圖3。由圖3a可得，重金屬質(zhì)量濃度在0～10 mg/L，菌體量隨重金屬離子濃度的增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，霉菌表現(xiàn)出最適生長速度，而隨著重金屬濃度的繼續(xù)增加，菌體量呈顯著性下降?？赡茉蚴牵亟饘贊舛仍龃髮?dǎo)致重金屬和抗生素間的交互作用而表現(xiàn)為先促進(jìn)而后協(xié)同殺菌。相反，圖3b結(jié)果表明，GSH含量與金屬離子濃度成反比，即隨著重金屬濃度的增加GSH含量明顯減少，說明重金屬的存在加速了菌體的氧化損傷，從而抑制了菌體內(nèi)GSH的合成。而圖3c顯示，重金屬對蛋白質(zhì)含量的影響主要表現(xiàn)為：低重金屬濃度下其值小幅增加，然后隨著重金屬濃度的升高而下降，當(dāng)重金屬濃度達(dá)到某一臨界值時(shí)，蛋白質(zhì)含量趨于平穩(wěn)。這可能是由于低濃度的頭孢拉定在重金屬的脅迫下對霉菌的抗氧化機(jī)制的抑制效果較顯著[14]。因此，在重金屬和抗生素的復(fù)合作用下，低濃度重金屬與抗生素共存時(shí)，菌體量、GSH和蛋白質(zhì)含量均較高，二者作用表現(xiàn)為協(xié)同抗性；高濃度時(shí)，菌體量、GSH和蛋白質(zhì)含量均較低，主要表現(xiàn)為協(xié)同殺菌，該趨勢與文獻(xiàn)[15]的研究結(jié)果一致。

不同濃度重金屬與鹽酸黃連素復(fù)合脅迫抗性見圖4。由4a可得，當(dāng)重金屬質(zhì)量濃度在0～10 mg/L時(shí)，菌體生長隨金屬離子濃度的微量增加呈正相關(guān)；當(dāng)重金屬離子質(zhì)量濃度超過10 mg/L時(shí)，菌體生長隨金屬離子濃度的微量增加呈負(fù)相關(guān)。這種變化趨勢與頭孢-金屬復(fù)合影響的變化趨勢一致，即當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/L時(shí)，霉菌出現(xiàn)最適生長速度。圖4b結(jié)果表明，GSH含量隨重金屬類型的不同而呈現(xiàn)不同變化趨勢，其中，GSH含量隨Cu2+濃度的升高而下降，GSH隨Cd2+濃度的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當(dāng) Cd2+濃度為50 mg/L時(shí)，GSH含量最高可達(dá)12.454 mg/g，GSH含量隨Cr6+濃度增加而變化不明顯，整體趨于穩(wěn)定狀態(tài)。這些變化趨勢與文獻(xiàn)[16-17]的研究結(jié)果相吻合。圖4c結(jié)果顯示，在鹽酸黃連素脅迫下，3種重金屬離子對蛋白質(zhì)含量的影響具有相同趨勢，即表現(xiàn)出溶液中蛋白質(zhì)含量整體變化不大趨于平穩(wěn)的狀態(tài)，說明重金屬離子與鹽酸黃連素復(fù)合作用對蛋白質(zhì)含量的影響比菌體、GSH的小。

結(jié)合圖3與圖4可以發(fā)現(xiàn)，在不同抗生素脅迫作用下相同濃度相同種類的重金屬體系中，木霉菌菌體量、GSH和蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)不同的變化特征。對菌體量而言，Cr6+與鹽酸黃連素復(fù)合作用使得菌體量變化梯度更大，說明其復(fù)合效應(yīng)較Cr6+與頭孢拉定的大。相反，Cu2+與頭孢拉定復(fù)合作用導(dǎo)致的菌體量變化顯著，因此其復(fù)合效應(yīng)比Cu2+與鹽酸黃連素的大，說明不同抗生素與同類重金屬復(fù)合作用對菌體量影響不盡相同。同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在GSH中，其中鹽酸黃連素脅迫下，Cr6+、Cu2+對GSH含量影響不明顯，不同濃度Cd2+對GSH含量的影響較顯著。而頭孢拉定脅迫下，不同濃度不同種類重金屬對GSH含量的影響均相當(dāng)顯著。而對于蛋白質(zhì)而言，其中鹽酸黃連素脅迫下，Cr6+、Cd2+對蛋白質(zhì)含量影響不明顯，不同濃度Cu2+對蛋白質(zhì)含量的影響較顯著；而頭孢拉定脅迫下，不同濃度不同種類重金屬對蛋白質(zhì)含量的影響不明顯。

2.2.2 重金屬種類和濃度與抗生素抗性的相關(guān)性分析 為了進(jìn)一步探究重金屬種類、濃度、抗生素種類以及二者復(fù)合作用對于抗生素抗性的影響效應(yīng)，將重金屬和抗生素對微生物復(fù)合作用的菌體量、GSH及蛋白質(zhì)含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表1～表3。

表1 霉菌菌體量的主效應(yīng)方差分析

表2 GSH含量的主效應(yīng)方差分析

表3 蛋白質(zhì)含量的主效應(yīng)方差分析

由表1可以看出，對于霉菌菌體量而言，重金屬種類影響效應(yīng)最小，其次為重金屬濃度，抗生素種類影響最顯著(F=5.988,P=0.022<0.05)，重金屬與抗生素的復(fù)合作用對菌體量的影響效應(yīng)不大。由表2可知，對于霉菌的GSH含量而言，抗生素種類影響效應(yīng)最小，其次是重金屬濃度，而重金屬種類有較大顯著的影響(F=10.755,P=0<0.05)。由表3可以看出，對于霉菌的蛋白質(zhì)含量而言，重金屬種類有極顯著的影響(F=9.071,P=0.001<0.05)，并且，重金屬種類+抗生素種類這種交叉污染的效應(yīng)對于蛋白質(zhì)含量也有較顯著的影響(F=21.494,P=0<0.05)，說明重金屬和抗生素存在交互作用，即重金屬脅迫霉菌的抗生素抗性有較為明顯影響。自然環(huán)境中，多數(shù)情況是污染物之間都以混合物狀態(tài)存在，因此復(fù)合污染在一定程度上影響了微生物的生長，同時(shí)也加劇誘導(dǎo)微生物抗性基因的出現(xiàn)[18]。相對于單一(抗生素或重金屬)的污染情況而言，當(dāng)兩者以不同濃度在環(huán)境中混合時(shí)，其復(fù)合污染作用可能會(huì)發(fā)生顯著性改變。這同文獻(xiàn)[19-20]等在探究大腸桿菌經(jīng)復(fù)合處理后的MIC增大幅度變小的結(jié)論相一致。

綜合重金屬變量和抗生素變量分析顯示，兩者皆是影響霉菌生長、GSH以及蛋白質(zhì)含量的重要因素，本研究利用不同重金屬和不同抗生素脅迫實(shí)驗(yàn)證明兩者存在交互作用，即重金屬脅迫霉菌的抗生素抗性具有顯著性影響。

3 結(jié)論

1) ITS分子鑒定和形態(tài)學(xué)分析結(jié)果表明，LJM-001菌株隸屬于Trichodermakoningiopsis。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果可得，該菌株同T.koningiopsis以及T.intricatu親緣關(guān)系相近，同為里氏木霉屬。

2)重金屬與抗生素復(fù)合污染下，當(dāng)重金屬的質(zhì)量濃度較低時(shí)(0～50 mg/L)，處于協(xié)同抗性；當(dāng)重金屬的質(zhì)量濃度較高時(shí)(100～200 mg/L)，則表現(xiàn)為協(xié)同殺菌。

3)對重金屬-抗生素復(fù)合抗性相關(guān)性分析表明，抗生素種類+重金屬濃度復(fù)合效應(yīng)對GSH含量影響顯著，重金屬種類+抗生素種類復(fù)合效應(yīng)對于蛋白質(zhì)含量及菌體量有較顯著的影響。